实验10　荧光光谱法测定饮料中氨基酸的含量

一、实验目的

1.掌握荧光光度法的测定原理及方法。

2.熟悉萃取荧光光度法测定的基本操作技术。

二、实验原理

氨基酸是蛋白质的基本结构单位和生物代谢过程中的重要物质，对氨基酸的分析技术已经广泛地应用于化工、轻工、食品加工、医药卫生等行业。食品添加剂、化妆品、饲料、泛酸等富含多种氨基酸，其中以丙氨酸为主，测定其中氨基酸的含量对产品开发具有一定意义。利用荧光光度法测定饮料中氨基酸的含量，该方法简便、快速、检测灵敏度高。

方法原理：根据Hantzsch反应，氨基酸与乙酰丙酮和甲醛能通过环化、缩合反应，生成N-取代基-2，6-二甲基-3，5-二乙酰基-1，4-二氢吡啶。该物质在473nm处发黄绿色荧光。该反应产物具有较大的共轭基团，形成环状结构，随共轭程度的增加，饱和键中的电子，其基态和激发态的能量差减小，可知其荧光发射量子效率增大，故产生较强的荧光。反应过程见式（2-9）。

反应产物受体系酸度的影响很大，所以要考察实验的最佳酸度。在氨存在下，乙酰丙酮和甲醛反应产生的荧光在一定范围呈线性。因此可采用标准曲线法进行定量分析。由于甘氨酸、亮氨酸、半胱氨酸等多种氨基酸的发射峰位置基本相同，故本法适用于多种氨基酸总量的测定。

三、仪器与试剂

1.仪器

F-7000荧光分光光度计，石英比色皿：1cm，水浴锅：0～100℃，酸度计：PHS-3C。

2.试剂

丙氨酸标准储备液：0.5mg/L。称取0.5g丙氨酸于烧杯中，加水溶解，转移至50mL容量瓶中。

丙氨酸标准溶液：50μg/mL。量取5mL丙氨酸标准储备液于50mL容量瓶中，加水定容。

甲醛溶液：准确量取2.0mL质量分数为36％甲醛于50mL容量瓶中，加水定容。

乙酰丙酮溶液：体积分数为2％。取1.0mL乙酰丙酮于50mL容量瓶中，加水定容。

乙酸-乙酸钠缓冲溶液：pH=3.0～6.0。

磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲溶液：pH=7.0～8.0。

碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液：pH=9.0～10.0。

四、实验步骤

1.丙氨酸-乙酰丙酮-甲醛体系的激发光谱和发射光谱绘制

准确移取2mL丙氨酸标准溶液于10mL比色管中，依次加入0.5mL乙酰丙酮溶液、0.6mL甲醛溶液和0.5mL缓冲溶液，混匀，于100℃水浴锅中加热10min后取出，避光保存，在冰水中冷却3min。加水定容至10mL，在仪器工作条件下在280～450nm范围内扫描激发光谱，在350～550nm范围内扫描发射光谱。确定最大激发波长和最大发射波长。

2.体系酸度选择

分别用pH值为3.0，5.0，6.0，7.0，9.0的缓冲溶液按第一步中的方法配制氨基酸标准溶液。分别在最大发射波长处测定荧光强度F。制作荧光强度与pH的关系曲线，找出最佳pH。

3.工作曲线

在上述最佳pH条件下，用丙氨酸标准溶液配制浓度分别为0μg/mL、4.0μg/mL、8.0μg/mL、10.0μg/mL、15.0μg/mL、20.0μg/mL的系列丙氨酸标准工作溶液，并进行荧光光谱扫描，在最大发射波长处测量不同浓度氨基酸的荧光强度F。

4.果汁中氨基酸含量的测定

取25mL经过滤的果汁饮料，依系列标准溶液的配制方法处理、测量荧光强度Fx。

五、数据记录及处理

1.确定丙氨酸-乙酰丙酮-甲醛体系的最大激发波长和最大发射波长。

最大激发波长λex________nm；最大发射波长λem________nm。

2.pH值对氨基酸荧光强度的影响

3.记录标准溶液荧光强度，以测得系列标准溶液的荧光强度（扣去空白）为纵坐标，以氨基酸浓度c为横坐标绘制工作曲线。用Excel或Origen软件拟合线性回归方程，求得线性相关系数R2。

4.记录果汁样品溶液的荧光强度。

将测得果汁的荧光强度（扣去空白）利用工作曲线求出果汁中氨基酸的浓度。

六、思考题

1.荧光光谱测量与紫外-可见光谱测量的比色皿有何不同？为什么？

2.荧光物质的激发光谱如何得到？需要设置哪些参数？