基因治疗的思路最早见于1963年Joshua Lederber的描述。1970年，Friedman和Roblin在《约克时报》首次提到基因治疗。1972年，他们在 Science上提出了人类遗传疾病的基因治疗( gene therapy)的概念。直到1990年，被誉为世界“基因治疗之父”、来自美国国立卫生研究院( National Institutes of Health，NIH)的Anderson博士实施了第一次真正意义上的基因治疗。4岁的小女孩Ahsanti De Silva因缺少腺苷脱氨酶( adenosine deaminase，ADA)而患重度联合免疫缺损和免疫系统功能低下。Anderson等通过收集患者的白细胞，导入外源性ADA编码基因，再把这些导入外源基因的白细胞重新输送回体内，使患者机体产生ADA的能力得到了提高。这一革命性的尝试拉开了基因治疗的序幕。

随着21世纪分子生物学及基因工程技术的迅猛发展，基因治疗已成为一大新的研究领域。在2009 年 Science杂志公布的年度十大科学进展中，基因治疗位列其中，并且其在遗传病治疗中的巨大潜力得到了肯定。在过去的十几年里，在全球范围，基因治疗的临床试验已取得了很大的进展。资料表明，从1989年至2010年，已开展了2000多例临床治疗，覆盖了肿瘤、传染病以及心血管方面的疾病。

FDA( Food and Drug Administration)在1993年对基因治疗给出的定义是:“针对活细胞遗传物质的修饰而进行的医学干预。细胞通过体外修饰，随后再注入机体;或将基因治疗产品直接注入体内，使细胞内发生遗传学改变。这种遗传学操纵的目的是能够预防、治疗、治愈、诊断或缓解人类疾病。”

随着基因工程技术的不断成熟，基因治疗又有广义、狭义之分。狭义的基因治疗为上述传统的概念，即通过基因转移技术将外源正常基因导入患者病变部位的靶细胞，通过控制目的基因的表达来校正、替代或补偿缺陷，从而恢复靶细胞、组织或器官的正常生理功能，进而实现治愈疾病的方法。广义的基因治疗则包括了狭义的基因治疗和利用基因药物进行治疗的方法。

根据接受外源基因的靶细胞的不同，还可分为体细胞基因治疗( somatic gene therapy)以及生殖细胞基因治疗( germ line gene therapy)。体细胞基因治疗可以被理解为一种将外源基因转移到体细胞内使之表达基因产物，进而校正该患者的遗传缺陷。而生殖细胞基因治疗则是将外源正常基因转移到患者的生殖细胞(精子、卵子或受精卵)或早期胚胎内从而校正缺陷的基因。前者只影响受试者本人，与后代无关;后者理论上能够永久地改变其子孙的遗传组成，是预防后代罹患特定遗传疾病的方法。

基因治疗的基本途径主要有两种:直接体内法( in vivo)和间接体内法( ex vivo)。

　直接体内法是将目的基因直接导入体内。如1994年美国科学家利用修饰过的腺病毒为载体，将治疗遗传性囊性纤维化病的正常基因成功地转入患者肺组织中。此方法较为简便，但其特异性、有效性以及载体和目的基因的安全性都有待完善。

　间接体内法是通过在体外分离培养靶细胞，将含有目的基因的载体在体外导入靶细胞，然后将细胞输回体内。该方法的优点是特异性好、靶细胞来源严格可控、移植入体内前可行安全性鉴定，降低病毒或其他毒性物质直接进入体内的危险性。缺点是技术相对复杂，局限于可移植细胞。

　目的基因是指准备导入靶细胞内，以研究、应用为目的的外源基因。外源目的基因的获取需要遵循如下原则:①保留基因自身的编码区、调控区和特殊启动子等原件;②保证基因结构的完整性。随着分子生物学和基因重组技术的发展，基因获取的手段日趋完善，主要通过以下几种途径:基因组DNA文库、cDNA文库、聚合酶链式反应( PCR)、人工手段合成等。

　靶细胞是接受外源目的基因的细胞。基因治疗的实施需要从患者体内选取合适的靶细胞在体外进行培养、增殖，从而获得足够数量的靶细胞。合适的靶细胞是基因治疗成败的关键。理论上讲，无论何种细胞均具有接受外源DNA的能力。但在再生医学中，靶细胞要求来源丰富、取材方便、容易培养、寿命较长。并且需要考虑到实际应用中疾病的性质与部位，根据具体目的和条件来加以选择。近年来，随着相关技术的发展，多种来源的细胞如间充质干细胞、角质细胞、肝细胞、皮肤成纤维细胞以及血管内皮细胞等得到越来越多的应用。

选定外源目的基因和靶细胞后，应选择适当的基因转移方法，将外源基因转移至靶细胞核内，使其在染色体上整合或成为不整合的游离片段。目前应用的基因转移方法主要有以下几种。①物理方法:电脉冲穿透法、显微注射及基因枪等;②化学方法:磷酸钙沉淀法、DEAE葡萄糖介导转染、脂质体转染法;③生物学方法:主要是以病毒为载体进行基因转移，例如，反转录病毒、腺病毒、疱疹病毒和腺病毒相关病毒载体等。其中，以反转录病毒为载体的基因转移率更高。具体内容可见本节的“基因治疗的转移系统”。

　就目前技术而言，一般基因转染效率很难达到100%。故首先需将转导细胞和未转导细胞加以区分，其次还需要鉴定转导细胞中外源基因的表达状况。常用筛选转导细胞的方法有:①利用基因表达产物筛选法: a.标记基因筛选法; b.基因缺陷型受体细胞的选择性法; c.基因共转染技术;②分子生物学方法包括:原位杂交、Southern杂交和打点杂交等。PCR法目前也已用于转导细胞的鉴定，且相对简单易行。

　确定了转导细胞，并证明外源基因能够表达所需产物后，将细胞输回患者体内，从而达到治疗患者疾病的目的。

不论体外还是或体内，基因转移都需要借助一定的方法或载体才能将外源目的基因导入靶细胞，这也是基因治疗的前提。根据所用的载体的不同，基因转移系统可分为病毒基因转移和非病毒基因转移系统:即分别通过病毒载体( viral vectors)或各种非病毒介质或载体( nonviral vectors)，从而实现基因的转移。

早在1968年，病毒载体就被用于基因转移的实验，随着后期一系列的研究开启了病毒载体的研究热潮，多种病毒载体相继出现，已成为基因治疗中的重要工具。

现有的病毒类载体可以分成整合型和非整合型病毒载体。前者可以整合于受体基因组使被转移的基因得以永久表达，如反转录病毒( retrovirus)和腺相关病毒( adeno-associated virus，AAV) ;后者独立于受体基因组外，进行瞬时表达，主要由腺病毒( adenovirus)衍生而来。

目前，已被改造用作基因转移的载体主要有: RNA病毒中的反转录病毒、慢病毒; DNA病毒中的腺病毒、腺相关病毒、单纯疱疹病毒及新近发展起来的EB病毒、痘病毒等。具体如下:

　反转录病毒( retrovirus，RV)是一种RNA病毒，含有env、gag、pol三个结构基因，分别编码病毒的被膜糖蛋白、核心蛋白和反转录酶。病毒进入细胞后，病毒RNA即反转录为双链DNA，并整合到细胞基因组中。早期的反转录病毒大多来源于禽类病毒，目前多以Moloney小鼠白血病病毒( Mo-MLV)为基本骨架构建而成。

利用反转录病毒设计构建缺陷型病毒( defective virus)载体，基本原理是去除病毒复制所需的基因并用目的基因取代。通过将缺失编码病毒外壳蛋白基因的反转录病毒感染含辅助病毒( helper virus)的包装细胞，在包装细胞内，缺失编码病毒外壳蛋白基因的反转录病毒不能合成外壳，而辅助病毒能合成蛋白外壳，故反转录病毒的RNA与辅助病毒的外壳蛋白结合，形成完整的病毒颗粒并分泌至包装细胞上清液中。将该上清液作用于靶细胞，则反转录病毒基因能够进入靶细胞从而使目的基因得到表达。

RV载体主要有以下几大优点:整合入宿主细胞后，能够稳定并持久地表达目的基因;基因容量较大;免疫原性低。因此是基因治疗中重要的工具载体。但存在着整合呈随机性;目的基因表达受到插入位点两侧的宿主DNA序列的影响;有致插入突变的可能;只能够感染分裂细胞等不足。目前在基础与临床研究中多适用于间接体内( ex vivo)基因治疗，特别是肿瘤的基因治疗。

　慢病毒( lentivirus，LV)属于反转录病毒中一个亚类，主要来源于人免疫缺陷病毒( HIV)、猫免疫缺陷病毒( FIV)和猴免疫缺陷病毒( SIV)。目前研究的多以人类免疫缺陷I型病毒( HIV-1)为基础构建。

慢病毒具有较复杂的基因组结构。除了含有 env、 gag、 pol三个基因外，还有 tat、 rev、 vpr、 vpu、 nef和 vif六个调节基因，其表达产物以各种方式调节病毒基因的表达。慢病毒载体的构建原理是将HIV-1基因组中的顺式作用元件(如包装信号、长末端重复序列)和编码反式作用蛋白的序列进行分离。载体系统包括包装成分和载体成分:包装成分由病毒基因组去除了包装、反转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能反式提供产生病毒颗粒所需的蛋白。包装成分通常被分开构建到两个质粒上，一个质粒表达gag和pol蛋白，另一个质粒表达env蛋白，其目的也是降低恢复成野生型病毒的可能。将包装成分与载体成分的质粒共转染细胞(如人肾293T细胞)，即可在细胞上清中收获只有一次性感染能力而无复制能力的、携带目的基因的HIV-1载体颗粒。载体成分与包装成分互补，含有包装、反转录和整合所需的HIV-1顺式作用序列。同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。为降低两种成分同源重组产生有复制能力的病毒的可能性，将包装成分的5＇LTR换成巨细胞病毒( CMV)立即早期启动子，3＇LTR换成SV40 polyA位点等。此外，还可将病毒的调控基因 vif、 vpr、 vpu和 nef去除掉，来进一步提高其安全性，将病毒的env蛋白替换成VSVG或MLV的env蛋白，可增加慢病毒感染宿主细胞范围。

慢病毒中的某些病毒蛋白(如整合素酶、基质)能使病毒整合前复合体转运入核内，病毒RNA在反转录过程中形成的独特三链DNA区域也能促进核的转运，而无需依赖细胞的有丝分裂。因此，慢病毒载体能用于感染不分裂细胞如神经元细胞、造血细胞、内皮细胞等，并能稳定整合入宿主染色体，持久稳定表达外源基因，从而达到良好的基因治疗效果，具有广阔的应用前景。

　腺病毒( adenovirus，AV)是一种无包膜的线性双链DNA病毒，在自然界中分布广泛。目前，人类腺病毒家族中已经发现50种以上的不同血清型，按凝血特性可分为A～F6个亚类。基因组约36kb大小，不同血清型基因组大小有所差异，其两端均具有反向末端重复序列( inverted Terminal Repeat，ITR)，病毒包装信号位于其内。腺病毒的转录分为早期与晚期转录，而介导早期转录的区域更为重要，其中E1、E2和E4编码调节蛋白，与病毒的复制密切相关。

类似于反转录病毒载体，AV载体是通过病毒的反式互补构建的。带目的基因的AV载体和用于同源重组的AV基因组大片段共转染293细胞，在细胞内两DNA片段同源重组为E1区缺失含目的基因的重组腺病毒片段，在293细胞产生的腺病毒E1蛋白激活下，产生包装蛋白，通过反式互补，即可以形成带外源目的基因的重组腺病毒。

AV载体的优点是导入效率明显高于反转录病毒，可制备获得滴度较高的病毒(＞10 ¹¹cfu/ml)，对分裂和非分裂细胞都有感染性，进入细胞内并不整合到宿主细胞基因组，瞬时表达，安全性高。缺点是无靶向性，插入片段一般也不能大于8kb，具有免疫原性，使外源基因不能在体内长期表达。

针对腺病毒载体的设计经历了多代不断地改进，第一代腺病毒载体是缺失了E1A、E1B区以及E3区的复制缺陷型病毒载体;第二代腺病毒载体将AV载体的E2区缺失，并突变或缺失E4区，降低宿主的免疫反应，提高安全性。第三代Ad可插入的外源基因更大，免疫反应进一步降低，载体中引入核基质附着区基因可使得外源基因保持长期表达，并增加了载体的稳定性。

　腺相关病毒( adenovirus-associated virus，AAV)属微小科病毒家族，是一种无被膜单链DNA缺陷型病毒，呈二十面体结构，是天然复制缺陷型病毒，单独存在时对正常细胞不发生毒性感染，只有在腺病毒、疱疹病毒等相关辅助病毒的共同作用下才发生毒性感染。

AAV含4. 7kb单链DNA基因组，基因组结构简单，仅包含病毒复制、整合和包装必需的顺式作用元件ITR序列和rep和cap两个编码基因，分别编码病毒复制和装配所必需的蛋白，rep蛋白的表达还与AAV的位点特异性整合有关，载体介导的外源基因可以定位整合到人19号染色体的S1位点上，进行长期稳定表达。

AAV2是最常用于基因治疗研究的载体，原理是利用外源基因及相应调控序列取代AAV的结构基因，保留ITR序列，并由另一个包装质粒反式提供rep与cap基因产物。

AAV具有位点特异性整合、可感染多种类型细胞、免疫原性和毒性低、致病性弱的优点。但也存在着如下缺陷:获得高滴度纯化的病毒液难度较大;病毒对外源基因容量小，仅4. 1～4. 9kb等。

　单纯疱疹病毒( herpes simplex virus，HSV)属于双链DNA有包膜的疱疹病毒。用作基因治疗载体的主要是HSV-Ⅰ型。Ⅰ型单纯疱疹病毒( HSV-Ⅰ)属于人嗜神经病毒，感染神经元细胞后，不被人体免疫系统所识别，处于潜伏感染的状态。当生理或周围神经受到一定的刺激后，潜伏的人单纯疱疹病毒可被激活，进入裂解性感染期。

HSV载体最大的优点为能携带容量较大的外源基因，可达30kb至50kb，因此可根据需要插入多个目的基因。感染宿主细胞范围广，包括分裂和不分裂细胞，尤其是对神经系统细胞易感，因此，主要用于神经系统疾病的基因治疗。其缺陷主要是细胞毒性大，载体系统制备困难。现研究主要致力于降低细胞毒性，提高细胞靶向性等。

　近年来，更多的病毒载体如EB病毒、牛痘病毒、巨细胞病毒( cytomegalovirus，CMV)、杆状病毒、水疱性口炎病毒等的出现丰富了基因治疗。各种类型的病毒载体有其独特的优缺点，怎样取长补短?故将各种病毒载体的有效部分进行拼接构建新型的杂交病毒载体渐渐成为目前研究的一大热点。例如: AAV-Ad杂交病毒载体，其基本原理利用了AAV的复制机制和Ad的包装过程，因而能有效发挥AAV载体大容量和Ad载体持久表达、感染不分裂细胞的优点，性能得到很大的提高。

病毒载体因其存在细胞毒性、免疫原性、潜在致瘤性等安全问题，且容纳的目的基因较小、制作成本高，因此受到一定程度的限制。与病毒载体转移系统相比，非病毒基因转移系统具有低毒性、低免疫原性，携带基因大小及类型不受限制等优点，受到人们广泛重视，已成为基因治疗的热点之一。

早期的方法例如磷酸钙沉淀、电穿孔、“基因枪”、直接注射等物理化学方法直接转染裸DNA，效果不甚理想。随着后期研究的进展，人们发现，DNA分子在高浓度或在加入乙醇、脂质体、阳离子多聚物或特定蛋白后，体积会缩小，从而提高穿膜的效率。基于上述发现，设计了一系列非病毒载体，常用的非病毒载体有脂质体和脂质复合物、阳离子多聚物、部分蛋白、多肽、纳米材料等。

脂质体和脂质复合物( liposome and lipoplexes)是磷脂依靠疏水缔合作用在水中自发形成的有序组合体，能够介导极性大分子穿透细胞膜，携带DNA进入细胞内。磷脂结构上包括极性部分(极性头部)和非极性部分(非极性尾部)。在水相中，非极性疏水尾部因疏水作用而相互聚集在一起，并同时将极性的亲水头部暴露于水相，可形成亲水基在外疏水基在内的类脂双层结构，以保护分子内疏水部分。暴露在水中的氨基等亲水基利用静电引力与DNA结合并将DNA大分子压缩为可运输小单元，形成脂质体复合物。生理状况下经内吞作用进入细胞后，形成内体。内体与溶酶体融合，经初级溶酶体、次级溶酶体、残余小体，最终被分解并排出体外。从而达到将外源DNA导入至细胞内的作用。

脂质体载体是目前应用最多的非病毒介导的基因转移系统，具有结构及成分设计中的机动性、制备方法的多样性、免疫原性小与安全性高等优点，但同时也存在着转染效率较低、基因多为瞬间表达、转移缺乏靶向特异性等不足。近年来通过对单一的脂质体修饰和改装，制备了包括纳米脂质体、热敏脂质体、免疫脂质体等新型脂质体，相信在未来的基因治疗领域将会有广阔的应用前景。

阳离子多聚物( cationic polymer)与DNA的结合主要是通过二者电荷间的相互作用。阳离子多聚物表面的氨基集团为正电荷，而DNA含有大量携带负电荷的磷酸基团，通过电荷作用可以使DNA缩合形成有序的纳米粒子，并借静电作用吸附于细胞表面，通过细胞内吞而将基因导入细胞，并获得表达。有研究表明，二者形成纳米复合物较为稳定，一级结构保持不变，只改变DNA的二、三级结构，能够保护DNA不受酶解。目前研究较多的阳离子聚合物主要有:聚乙烯亚胺、多聚赖氨酸、聚酰胺-胺型树状聚合物、壳聚糖等。

早在1995年，聚乙烯亚胺( polyethylenimine，PEI)就已经成功地用于介导寡肽的传递，是目前非病毒基因载体研究领域的一大热点。其单体结构( CH—CH ₂—NH ₂)中含有可质子化的氨基(富含阳离子)，有较强结合DNA和黏附细胞的能力，在较宽pH范围内都具有很强的缓冲能力。PEI的“质子海绵”( proton sponge)作用，能够促进溶酶体肿胀破裂，使PEI/DNA复合物得以进入胞质。

PEI具有不需受体介导、不需溶酶体抑制剂就可转染细胞的优点，但由于PEI是有机聚合物，不易被细胞内的酶代谢，易在核内聚集而引起细胞毒性。因此，目前的研究主要集中在对其进行结构的改性，通过构建PEI衍生物，降低细胞毒性，进一步提高转染效率。

多聚赖氨酸( poly-L-lysine，PLL)是赖氨酸的共价多聚物，聚合力主要依赖于氢键，是较早用于基因导入的阳离子聚合物材料。对DNA具有强大的聚合力。目前已成功地将PLL缩合DNA形成的纳米粒用于基因导入。

PLL的一个显著优势在于它易于化学修饰，能够与内皮生长因子、乳糖、RGD肽等配体结合增强载体的靶向性。PLL基因载体的主要缺点是高分子量PLL的细胞毒性、复合物的聚集与沉淀以及靶向递送等问题。目前的研究主要通过对PLL的修饰来解决;用于修饰PLL的材料应用较多的是聚乙烯二醇( polyethylene glycol，PEG)，聚乳酸-羟基乙酸共聚物( polylactic-polyglycolic acid，PLGA)等。还有学者尝试把PLL与无机纳米材料相连接，结合二者的优点以获得更有效的基因转导效率。

聚酰胺-胺型树枝状聚合物( polyamidoamine dendrimers，PAMAM)由三维多枝化的树突组成，纳米级大小，通常为球形，主要由中心核区( C)，支链单元( B)和表面基团( S)等三部分组成，有多个末端氨基。在生理pH下，这些氨基发生质子化，使PAMAM带上球体聚阳离子特征。PAMAM由甲基丙烯酸酯与1，2-乙二胺不断反复的加成、取代反应合成，树枝状聚合物的大小由其反应的代数来标明，即引发剂上发生一次反应后，树枝状聚合物为0代( G0)，以后每重复一次反应，代数加1。

影响PAMAM转染效率的主要因素有: PAMAM代数、PAMAM与DNA间电荷比例( r)等。其中，以G5-G10 PAMAM的转染效率最高。PAMAM因其分子质量均一可控、形状规整(呈球状)、表面分布许多氨基，在生理pH值下带正电荷等优点。针对PAMAM的化学改性主要集中在细胞毒性、复合物性质、细胞亲和性、内涵体释放和靶向性等方面。

壳聚糖( chitosan)是甲壳素的脱乙酰化后的产物，是自然界中唯一带正电荷的多糖，通过静电吸引和氢键与带负电荷的DNA结合。壳聚糖的转染效率与其相对分子质量、氨基与DNA磷酸基比例N/P比、脱乙酰度、pH、DNA浓度、血清浓度等因素有关，且在不同细胞中其转染效率也不一。随相对分子质量和脱乙酰度增加，壳聚糖复合DNA的能力增强，转染效率提高。

壳聚糖对DNA有很好的结合和保护作用，对生物体无毒、相容性好，还具有一定的抑制微生物和抗癌作用，体内外实验已初步显示出良好的应用前景。目前的研究重点是优化转染条件，提高转染效率。

　蛋白质中的某些特定结构域能够结合目的基因，并以非受体依赖方式进入细胞，从而介导基因的转移。目前研究的较多的有鱼精蛋白( protamine)、细胞膜穿透肽( cell penetrating peptides，CPPs)、组蛋白( histone)等。此类肽疏水性较强，含有核定位信号( NLS)，与目的基因形成复合物后可促进目的基因与细胞膜融合、内吞，并直接导入细胞核，且复合物的大小比传统脂质复合物小，介导基因转移的效果优于传统脂质复合物。

基因治疗中的无机纳米粒子主要有:硅、铁氧化物、磷酸钙、金属纳米粒子等。通过将目的治疗基因或治疗分子包裹在纳米颗粒之中或吸附在其表面，通过内吞入胞等方式被转运至靶细胞内，然后将基因导入胞核并发挥功能。无机纳米粒子载体具有浓缩及保护目的基因的作用、装载容量较大、表面性质优良、免疫原性低，在未来的基因转染领域存在着巨大的应用潜力。

除以上所述内容外，科研人员仍在现有基础上不断进行优化、研发新型的非病毒类载体基因转移系统，如:原位交联非病毒基因载体聚合物传递体系、两亲性非病毒基因载体聚合物传递体系、配体增强型非病毒基因载体聚合物传递体系等。通过对非病毒基因载体基础和应用的深入研究以及各学科的共同努力，基于非病毒基因载体的基因治疗在不久的将来有望取得更大的突破。