1.2　国内外研究现状及发展趋势

1.2.1　生物地球氧化还原——全球物质循环的驱动力

许多元素如碳（C）、氮（N）、硫（S）、铁（Fe）和锰（Mn）以及易于氧化还原的微量元素如砷（As）、铬（Cr）、铜（Cu）、铀（U）的生物地球化学循环是由氧化还原过程驱使的。这些元素的化学形态、生物可利用性、毒性、在环境中的移动性直接受氧化还原反应的影响。此外，其他不具有氧化还原活性的元素和化合物的生物地球化学行为可能间接地与天然有机物和矿物的氧化还原转换有关，特别是铁的氢氧化物、锰矿物、含铁黏土矿物、铁硫化物。氧化还原活性基团与腐殖质和矿物表面相结合可进一步催化离子和分子，包括许多有机污染物的氧化或还原（Ginder-Vogel et al.，2005；Kappler and Haderlein，2003；Polizzotto et al.，2008；Wu et al.，2006）。由此可见，氧化还原过程可以为环境污染治理工程提供新的战略机遇，了解环境中氧化还原界面的生物地球化学过程对保护环境生态系统健康是至关重要的。

1.2.1.1　氧化还原过程与碳、氮、磷元素循环

地球上所有生命的能量都来源于氧化还原过程。生物质的生产需要通过电子转移将碳元素、常量营养元素（如N、S）和微量营养元素（如Fe、Mn）形成合适的氧化态进入生物分子中。地球诞生之前，生物氧化还原活性已经使氧化性的环境表面覆盖了还原性物质，如有机物、硫化物和甲烷。沿着全球性的氧化还原梯度，许多潜在的电子供体、电子受体和碳源可以合成大量的在生态和代谢上具有多样性的微生物（DeLong and Pace，2001）。

碳循环是由有氧光合作用驱动的，它通过失去水中的电子，固定二氧化碳，并产生氧气。另外，非氧光合作用和化学无机自营养所固定的碳可能是局域性环境尤其是极端环境下最重要的生物质来源（D’Hondt et al.，2002）。有机质和其他还原性物质前期在沉积物中的埋藏以及后期隆起暴露在地球表面所发生的风化氧化过程是控制地质时间尺度上的大气组成和地球气候变化的关键过程（Berner，1999）。

环境中氮、磷的行为与碳的氧化还原过程密切相关。氮存在多种氧化态，它们的许多氧化还原过程，如固氮、硝化、反硝化、异化硝酸盐还原为氨都是由微生物驱动的。这些微生物过程影响氮素的供应，进而影响当地乃至全球范围内有机质的生产和循环（Howarth，2002）。类似这样的关联同样存在于铁、硫、磷和重金属元素的氧化还原循环中（Moore，2014）。例如，黄铁矿氧化作用是含水层中硝酸盐循环的重要途径，然而，该过程产生的硫酸盐可能刺激硫酸盐的微生物还原，这反过来可能会导致硫酸盐将溶解态氢氧化铁（Ⅲ）还原（Flynn et al.，2014；Friedrich and Finster，2014）。再有，当富含磷酸盐的地下水排放进入地表水体可能会造成富营养化（Lucassen et al.，2004）。上述这些例子说明了生物地球化学氧化还原循环之间存在高度的耦合。

1.2.1.2　氧化还原过程与铁、锰矿物的动态变化

作为地球表面最丰富的过渡金属，铁在环境生物地球化学中发挥着重要作用。氧化态铁在极端酸性条件下可溶，但在近中性pH条件下Fe（Ⅲ）沉淀形成氢氧化铁，氢氧化铁表面能够催化环境中许多重要的氧化还原反应。在还原条件下，氢氧化铁会被无机物如硫化物还原，从而可能释放出有害的吸附物（Afonso and Stumm，1992）。此外，Fe（Ⅲ）矿物可能作为终端电子受体被异化铁还原细菌微生物还原。这些微生物在土壤、淡水和海洋环境中无处不在，它们能够将有机化合物在细胞质内的氧化和细胞外难溶Fe（Ⅲ）矿物质的还原结合起来，从而通过磷酸化作用中的电子转移获得能量（DiChristina et al.，2005）。Fe（Ⅲ）矿物的还原产生可溶性Fe（Ⅱ）和各种次生矿物，包括Fe（Ⅱ）矿，如蓝铁矿［Fe₃（PO₄）₂］和菱铁矿（FeCO₃），Fe（Ⅲ）矿物（如针铁矿）和Fe（Ⅱ、Ⅲ）混合铁矿，如磁铁矿（Fe₃O₄）和绿铁锈（层状双氢氧化物）。溶解态、吸附态和固态Fe（Ⅱ）在一系列生物氧化还原过程中可以作为强还原剂（Liger et al.，1999；Lloyd et al.，2000）。

Fe（Ⅱ）的氧化可由好氧微生物和厌氧微生物介导。微生物介导的Fe（Ⅱ）氧化在较低pH值环境下就可以进行，但在这样的条件下化学氧化则无法进行。在近中性pH条件下，Fe（Ⅱ）的微生物氧化将会和Fe（Ⅱ）的快速化学氧化竞争。因此，在氧含量低的条件下特别是好氧-厌氧界面，例如被水淹没的植物根部附近，这些氧化铁（Ⅱ）的微生物将占据一定的优势（Druschel et al.，2008）。在嗜中性、缺氧的环境中，硝酸盐依赖型Fe（Ⅱ）氧化微生物可利用硝酸盐和氧化锰（Ⅳ）作为电子穿梭体来促使Fe（Ⅱ）的氧化（Kappler and Straub，2005）。

锰氧化物矿物会参与环境中各种氧化还原反应，例如，水钠锰矿（δ-MnO₂）直接氧化硒（Ⅳ）为硒（Ⅵ），氧化铬（Ⅲ）为铬（Ⅵ），氧化砷（Ⅲ）为砷（Ⅴ）（Post，1999）。锰（Ⅱ）的氧化可发生在各种环境中并可由多种细菌和真菌介导（Miyata et al.，2006）。生物介导的锰（Ⅱ）氧化所产生的最初产物通常结晶性很差，为层状氧化锰（Ⅳ）矿物。虽然锰（Ⅱ）氧化的最终矿物形态往往取决于锰（Ⅱ）氧化期间及之后的地球化学条件，但生物介导的锰（Ⅱ）氧化通常被认为是环境中锰氧化物的主要来源途径（Tebo et al.，2004）。

自然界水体中铁（Ⅲ）和锰（Ⅲ、Ⅵ）矿表面结构和反应活性会受无机吸附物和天然有机物影响（Bauer and Kappler，2009；Borch et al.，2007）。腐殖质具有氧化还原活性，其作为微生物与矿物质之间的电子穿梭体能够促进不溶性Fe（Ⅲ）矿物为微生物利用（Kappler et al.，2004）。腐殖质还可以通过络合、增加金属离子可溶性、在矿物表面吸附等方式进一步影响铁、锰矿物的形成，进而导致结晶矿石无法形成（Eusterhues et al.，2008；Jones et al.，2009）。Fe（Ⅲ）和Mn（Ⅳ）对天然有机物、磷酸盐、碳酸盐的强烈吸附可能会导致其所吸附的污染物发生解吸，但也可以阻止矿物对微生物的吸附，从而保护固相物质不被酶还原（Borch et al.，2007）。

1.2.1.3　氧化还原过程与重金属转化

一些微量重金属，如铬、铜、钴、银、锝和汞可能以一些氧化态存在，其还原转化可能以化学方式进行，如铜（Ⅱ）可被二价铁离子（Fe2+）或者硫氢酸（H₂S）还原为Cu（Ⅰ），Cu（Ⅱ）、Ag（Ⅱ）和Hg（Ⅱ）可被由绿锈中存在的Fe（Ⅱ）还原为基本态（O’Loughlin et al.，2003）。此外，微生物也可以通过异化或者解毒途径直接还原具有一定毒性甚至剧毒的金属（如Cr、Hg、U）（Lovley，1993）。例如，最近基于X射线吸收近边结构（XANES）和透射电镜（TEM）的研究结果表明，洪涝时岸边的污染土壤中金属铜的形成可能是一种细菌解毒的结果（Weber et al.，2009a；Weber et al.，2009b）。微量金属的还原可以降低其移动性，比如可溶性铬（Ⅵ）还原为难溶性铬（Ⅲ），Hg（Ⅱ）还原为挥发性Hg（0）（Lovley，1993）。

微生物硫酸盐还原作用可能导致难溶性亲铜重金属元素的沉淀（Kirk，2004）。在富含硫的沉积物中，亲铜重金属元素可能与铁硫化物发生共沉淀或者形成其他金属的硫化物（Morse and Luther，1999）。然而，在被污染的淡水湿地中发现亲铜重金属元素的可利用性可能超过可还原硫化物，亲铜重金属元素的动态变化可能受生物硫化物共沉淀的竞争影响（Weber et al.，2009b）。与难溶金属硫化物的共沉淀作用相比，金属硫化物族的形成可能更会显著提高金属在厌氧环境中的流动性，而且由于其在动力学上的稳定性，使其可以在好氧水体中存在（Luther and Rickard，2005）。最近发现，在污染的河岸土壤中硫酸盐的还原作用可通过促进富铜硫化物胶体的形成来提高铜、铅和镉的移动性（Weber et al.，2009a），这与金属硫化物胶体能够提高水体等其他环境介质中污染物的移动性的说法相吻合（Deonarine and Hsu-Kim，2009）。

砷的移动性、生物可利用性、毒性和环境命运受生物地球化学过程所控制，其控制方式主要是通过形成或者破坏砷的承载相、改变砷的氧化还原状态与改变砷的化学组成（Dixit and Hering，2003）。在中性pH条件下，Fe（Ⅱ）的非生物和微生物氧化使之转化为溶解性较小的Fe（Ⅲ）矿物，从而导致砷被吸附在次生铁矿物中而被固定（Dixit and Hering，2003）。然而，厌氧光合细菌、硝酸还原菌、Fe（Ⅱ）氧化细菌也能耐受高浓度砷并提供合适的途径来使得Fe（Ⅲ）与砷发生共沉淀（Hohmann et al.，2010）。在富含氢氧化物铁（Ⅲ）的蓄水沉积物中，持续的、长期的还原条件可能会使得吸附剂耗尽，从而发生砷的移动（Tufano and Fendorf，2008），但这种现象是极其罕见的。总之，Fe（Ⅲ）和Fe（Ⅱ）直接的生物地球化学氧化还原过程能够控制砷的移动性。

砷的移动性和毒性不仅受存在的合适的吸附剂的影响，同时也受其氧化还原形态的影响，通常认为砷还原态比其氧化态更易移动、具有更高毒性。许多生物地球化学过程可以直接或间接导致砷的氧化还原，例如Fe（Ⅱ）-针铁矿系统，或过氧化氢反应形成的Fe（Ⅳ）可以氧化砷（Ⅲ）（Amstaetter et al.，2010；Hug and Leupin，2003）。还有学者提出细菌也可以通过将As（Ⅴ）还原或者As（Ⅲ）氧化而改变其氧化还原状态来控制砷的移动性和毒性（Tufano et al.，2008），尽管这还不具有普遍性，但其反映出微生物对砷具有一定的解毒功能（Kulp et al.，2008）。此外，有些微生物还可以分泌活性有机或无机化合物与As（Ⅲ）或As（Ⅴ）发生氧化还原反应。最近研究还表明，腐殖质和醌模型化合物中的半醌自由基和氢醌也可以氧化砷（Ⅲ）为As（Ⅴ），或还原As（Ⅴ）为As（Ⅲ）（Jiang et al.，2009；Redman et al.，2002）。

在好氧环境中，铀普遍以六价氧化态铀［U］存在，U（Ⅵ）在大多数环境条件下是可溶的，尤其是当U（Ⅵ）与碳酸盐结合时溶解性更大（Guillaumont et al.，2003）。相反，U（Ⅳ）溶解性较小，即使有地下水配体如碳酸钙存在时，U（Ⅳ）仍趋于相对稳定（Wu et al.，2006；Wu et al.，2007）。事实上，目前正在探索一种可能的铀微生物修复技术，实现原位修复U（Ⅵ）为U（Ⅳ）（Williams et al.，2013）。

在低温地球化学环境中，非生物U（Ⅵ）的还原可通过若干途径进行，但这些途径会受到许多条件的限制（Borch et al.，2010）。相反，许多普通的金属还原菌和硫酸盐还原菌可以将有机质与H₂的氧化作用和铀（Ⅵ）的还原作用联系起来，从而生成铀（Ⅳ）和晶体铀矿沉淀（Gorby and Lovley，1992）。然而，作为电子受体的硝酸盐或氢氧化铁（Ⅲ）的存在和潜在的U（Ⅳ）氧化剂可能在一定程度上会阻碍U（Ⅵ）的生物还原（Stewart et al.，2009）。

潜在的UO₂氧化剂包括分子氧、硝酸盐、硝酸盐还原中间体、氢氧化锰（Ⅳ）和氢氧化铁（Ⅲ）（Borch et al.，2010）。此外，UO₂还可以被生物活性物质催化氧化。硝酸盐是一种常见的铀的共污染物质，它不仅能够阻碍铀的生物还原，还有可能氧化铀（Ⅳ）（Senko et al.，2005）。硝酸盐氧化铀在热力学上是可行的，但在动力学上是受限的（Senko et al.，2005）。尽管由生物介导的将N转化为N、NO和N₂O可以提高U（Ⅳ）的氧化速率，但与Fe（Ⅲ）和O₂氧化U（Ⅳ）的速率相比还是显得相当缓慢。在普通地下水环境中，U（Ⅳ）/U（Ⅵ）的氧化还原电位和Fe（Ⅲ）氢氧化物/Fe（Ⅱ）的氧化还原电位相类似，因此，液相和固相的化学物质发生微小的变化都会导致Fe（Ⅲ）氢氧化物氧化UO₂的途径在热力学上时而可行、时而不可行（Ginder-Vogel et al.，2006）。脱氮硫杆菌和地杆菌能够催化硝酸盐而促进U（Ⅳ）的氧化，但目前尚不清楚这两种细菌是否能够从这个过程中获得能量（Beller，2005）。

相对于U，Pu和Tc的生物地球化学循环的特点不明显。在环境系统中Tc主要以可溶性Tc（Ⅶ）或相对可移动性Tc（Ⅳ）存在。在缺氧条件下，许多细菌能够催化还原Tc（Ⅶ）为Tc（Ⅳ），形成Tc（Ⅳ）氧化物（Fredrickson et al.，2004）。此外，溶解的和吸附的Fe（Ⅱ）作为一种微生物的还原产物也是Tc（Ⅶ）的强还原剂，然而氧气又会将Tc（Ⅳ）氧化可能是阻碍还原态锝固定的一个重大因素（Fredrickson et al.，2004）。

在环境中，Pu通常以Pu（Ⅲ）、Pu（Ⅳ）、Pu（Ⅴ）或Pu（Ⅵ）态形式存在。通常认为Pu（Ⅳ）移动性较差，而Pu（Ⅵ）移动性最强，而Pu（Ⅴ）通常只是在环境中短暂存在（Icopini et al.，2009）。Pu（Ⅲ）、Pu（Ⅳ）、Pu（Ⅴ）通常会被Mn（Ⅳ）氧化成Pu（Ⅵ）从而广泛存在于环境中（Powell et al.，2006）。与U相似，氧化态Pu（Ⅴ、Ⅵ）也可以被金属还原细菌如地杆菌和希瓦氏菌还原为Pu（Ⅳ）或Pu（Ⅲ）（Icopini et al.，2009）。

1.2.1.4　氧化还原过程与有机污染物降解

有机污染物在环境中广泛分布，锰、铁等矿物质以及腐殖质可能会大大影响到众多有机污染物的氧化和还原转化过程。这些反应途径与速率取决于矿物类型、化学溶液和微生物活性。同样该过程也可以设计成修复策略，如通过可渗透性反应层（PRB）来减小地下水中有机（和无机）污染物的蔓延。

几项研究结果已经表明，相对于纯净的Fe2+，Fe（Ⅲ）氧化态，如与Fe（Ⅱ）反应的赤铁矿可以显著提高许多还原性污染物如硝基芳烃、氯化溶剂、农药和消毒剂的转化速度（Amonette et al.，2000；Borch et al.，2005；Hakala et al.，2007），但还没有研究清楚的是与Fe（Ⅱ）反应为何会提高Fe（Ⅲ）氧化物的表面活性。Vikesland和Valentine（2002）研究了各种铁氧化表面Fe（Ⅱ）和氯胺反应的动力学，发现铁的氧化物对这些反应起着至关重要的作用。此外，针铁矿活化的Fe（Ⅱ）还原硝基苯反应只能发生在Fe（Ⅱ）水溶液中（Williams and Scherer，2004）。Fe（Ⅱ）氧化还原活性的增强不仅在氧化物存在时能观察到，在其他主要铁矿物存在时也能观察到。六氯乙烷和4-氯硝基苯的表面反应速率顺序为：Fe（Ⅱ）+菱铁矿<Fe（Ⅱ）+铁氧化物<Fe（Ⅱ）+铁硫化物（Elsner et al.，2004）。磁铁矿的粒径大小和聚集状态会影响四氯甲烷的还原转化（Vikesland et al.，2007）。另外，最近的一项研究表明，磁铁矿中Fe（Ⅱ）/Fe（Ⅲ）的化学计量比可能会改变磁铁矿颗粒的氧化还原性质，从而更有利于硝基苯还原（Gorski and Scherer，2009）。

细菌与厌氧性有机污染物如甲苯和氯乙烯相结合能够还原电子载体（如腐殖质），被还原的电子载体可以进一步转移电子到一些吸电子化合物中，如偶氮染料、多卤代化合物、硝基芳烃（Van der Zee and Cervantes，2009）。研究显示，氢醌基团还原的胡敏酸和模型化合物（如AQDS）会对硝基化合物的还原动力学和降解途径都产生显著影响（Borch et al.，2005；Van der Zee and Cervantes，2009）。

除了通过金属氧化物和有机物质在自然条件下转化污染物，PRB代表了处理污染地下水的一种环境修复技术（Gillham and Ohannesin，1994）。以零价铁为基础的PRB已经被证明可以有效去除包括卤化有机溶剂在内的多种污染物（O’Hannesin and Gillham，1998）。通常情况下，随着时间的推移，零价铁被氧化形成氢氧化铁导致PRB反应活性降低。然而，最近的研究表明，通过铁还原细菌的生物强化作用有可能改善PRB性能（Van Nooten et al.，2008）。

相对于零价铁对有机污染物的还原处理，高锰酸盐是通常用于有机化合物的原位化学氧化剂，其有效pH值范围宽，易于处理，而成本相对较低。高锰酸钾能够氧化多种有机污染物，如1，4-二氧杂环己烷、甲基叔丁基二甲醚、甲基乙基酮、爆炸物［如三硝基甲苯（TNT）］、农药（如涕灭威和敌敌畏）、酚类化合物（如对硝基苯酚）和氯化物（如四氯乙烯）（Waldemer and Tratnyek，2005）。另外，最近的研究还表明，土壤中常见的锰氧化物（如水钠锰矿）也可以氧化常见的污染物如抗菌药物（如酚、氟喹诺酮类、芳香性的N-氧化物和四环素类）、双酚A以及17α-炔雌醇（Lin et al.，2009；Zhang et al.，2008）。

1.2.2　微生物胞外呼吸——基于界面电子转移的氧化还原过程

微生物胞外呼吸（extracellular respiration）是近年来新发现的在厌氧条件下微生物能量代谢的方式，指厌氧条件下微生物在胞内彻底氧化有机物释放电子，产生的电子经胞内呼吸链传递到胞外电子受体使其还原，并产生能量维持微生物自身生长的过程。它是一种涉及电子在微生物细胞与胞外电子受体/电子供体之间传递的呼吸方式。从化学角度来看，微生物胞外呼吸本质上是一种由微生物介导的氧化还原过程。在理论方面，微生物胞外呼吸的发现为呼吸链电子传递、胞外电子转移、能量产生途径等科学问题提供了新的视角。在应用方面，微生物胞外呼吸在碳、氮、硫等元素生物地球化学循环、污染物转化消减和微生物产电等方面发挥了积极作用（Lovley et al.，2004），表现出巨大的应用潜力。

1.2.2.1　微生物胞外呼吸菌

微生物胞外呼吸菌在环境中广泛存在，人们已经在土壤、泥炭、污泥、湖泊沉积物、河流沉积物、海洋沉积物以及水体等环境介质中分离富集出了许多具有胞外呼吸功能的微生物。根据胞外电子受体的不同，微生物胞外呼吸菌主要分为腐殖质还原菌、异化金属还原菌和产电微生物。除了常规微生物，许多极端环境微生物也具有胞外电子传递能力，如嗜热菌、嗜酸菌、嗜碱菌等。按照对氧气的需求，胞外呼吸菌又分为兼性厌氧菌和严格厌氧菌。胞外呼吸菌大部分集中在变形杆菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Acidobacteria）与厚壁菌门（Firmicutes）三个门。已发现的胞外呼吸菌种大多数为革兰氏阴性菌，只有少数为阳性菌。产电微生物主要是人工驯化产生的，通过对各种沉积物进行电极富集培养实验发现，大部分产电微生物菌种的16S rRNA基因序列与δ-变形菌（Desulfoarculus baarsii）的相似度可达76%～95%（Holmes et al.，2004）。目前报道的胞外呼吸菌的数量仅占自然界的极小部分，而且很多菌的功能机制还不完全清楚。随着研究的不断深入以及微生物分离方法和分子生物学方法的不断完善，胞外呼吸菌资源将会持续不断被发现和丰富。

有些微生物有多种胞外呼吸途径的功能，例如希瓦氏菌属（Shewanella）和地杆菌属（Geobacter）。这两种菌属也是目前研究最深入和最系统的胞外呼吸菌，已经成为异化金属还原菌群中的模式菌（Weber et al.，2006），而且希瓦氏菌（Shewanella oneidensis MR-1）和地杆菌（Geobacter sulfurreducens PCA）的基因组已经全部测序完成（Heidelberg et al.，2002；Meth􀆧 et al.，2003）。两种微生物基因组的研究发现，在希瓦氏菌和地杆菌中分别有42个和111个与细胞膜相关的细胞色素c基因，但已经确定功能的细胞色素c只有几种，大量的基因功能还不完全清楚，需要进一步探索。正是由于这些大量蛋白酶参与了无氧呼吸过程，使得微生物的胞外呼吸途径研究变得非常复杂。

希瓦氏菌是兼性厌氧菌，较容易培养，在厌氧条件可以利用金属氧化物［包括Fe（Ⅲ）、Cr（Ⅵ）、U（Ⅵ）、Mn（Ⅲ）及Mn（Ⅳ）矿物氧化物］、延胡索酸盐、硝酸盐、氧化三甲胺、硫酸二甲酯、亚硫酸盐、硫代硫酸盐以及单质硫等作为胞外电子受体（Myers and Nealson，1988），具有如此多样的胞外电子受体是其他任何胞外呼吸菌所不具备的。地杆菌被认为是环境中最主要的铁还原类群，可以利用有机物/有机污染物、乙酸盐、H₂等作为电子供体，除了可以还原Fe（Ⅲ）外，还可还原重金属（Williams et al.，2011）。

1.2.2.2　微生物胞外呼吸电子传递过程

（1）胞内电子传递过程

随着希瓦氏菌属全基因组序列的测定和分析，对胞内电子传递过程的认识已经深入到分子水平。胞内电子传递过程中的第一步是脱氢酶从电子供体脱下电子，传递给醌类中间体。胞内电子传递过程中的第二步是电子从醌类中间体传递给CymA（位于内膜多血红素细胞色素c，是电子通过醌向周质传递的切入点）。胞内电子传递过程中的第三步是电子从CymA传递至周质细胞色素，目前已经发现的周质细胞色素主要是四血红素黄素细胞色素（Ifc3）和四血红素细胞色素（Cct）（Dobbin et al.，1999；Reyes-Ramirez et al.，2003）。胞内电子传递过程中的第四步是电子由周质细胞色素向外膜蛋白传递，目前发现镶嵌在周质和外膜上的色素蛋白（MtrA，位于周质，是可溶性的细胞色素c，含有10个血红素）是这一过程的主要电子受体，MtrA缺失将导致细胞与胞外电子受体之间的电子传递下降90%以上（Beliaev et al.，2001；Myers and Myers，2002；Pitts et al.，2003）。在还原可溶性电子受体时，与MtrA序列同源性较高的MtrD和DmsE可以部分代替MtrA，但还原不溶性电子受体时MtrD和DmsE则不能代替MtrA（Coursolle and Gralnick，2010）。胞内电子传递过程中的第五步是电子从MtrA向胞外传递，即外膜电子传递。尽管目前关于外膜电子传递的机制还不甚清楚，但有一个共同的认识是，无论是将电子直接传递至不同的电子受体或是传递至可溶性的电子穿梭体，外膜蛋白细胞色素c（OM c-Cyt）在这一过程中扮演着至关重要的角色（Lovley et al.，2011）。MtrB（非细胞色素，预测为跨膜蛋白）接受MtrA的电子，并传递给外膜的OmcA和MtrC（位于外膜表面，均为脂蛋白，每个多肽包含10个血红素），后两者通常被认为是希瓦氏菌胞外电子传递的末端还原酶，它们经常以2∶1的复合体出现。体外实验表明，OmcA和MtrC单独作用时也可以还原不溶性三价铁，但二者结合后的复合体的电子传递能力远大于单独作用时的电子传递能力（Shi et al.，2006）。OmcA或MtrC的缺失都会导致产电量的大幅下降，但两者共同突变不会导致产电的完全消失，表明产电过程中存在多种的电子传递机制共存的现象或者OmcA或MtrC并不是唯一的末端还原酶（Coursolle and Gralnick，2010）。地杆菌属的胞内电子传递机制与希瓦氏菌属类似，但在具体细胞色素类型上有所不同，一般认为地杆菌属细胞质膜蛋白酶为MacA，周质蛋白酶为PpcA，外膜终端还原酶为OmcB、OmcC、OmcE、OmcS、OmcT与OmcZ（Inoue et al.，2010）。此外，在地杆菌属细胞外膜上还发现一对了解不多但十分重要的多铜蛋白酶OmpC和OmpB，它们对Fe（Ⅲ）的还原和电子转移到阳极都是非常重要的。

所有OM c-Cyt都呈现出类似的结构，由具有氧化还原活性的血红素分子和氨基酸组成的肽链缠绕形成，其中血红素的中心位置Fe轴向配位了双组氨酸残基接入肽链中（Clarke et al.，2011；Leys et al.，2002；Richardson et al.，2012；Shaik，2010）。这些具有氧化还原活性中心的蛋白位于细胞膜上，是电子从胞内到胞外的通道，这些蛋白中暴露于溶剂中的血红素分子在电子传递过程中可能会直接接触电子受体分子或界面，但其中的相互作用机制还有待研究。

Shewanella属包含编码为mtfDEF-omcA-mtfCAB的基因族（Coursolle and Gralnick，2010；Shi et al.，2007）。MtrA与MtrB组成了跨外膜的电子传递复合体，包括β-折叠的孔蛋白（MtrB）以及嵌在其中的十血红素辅基细胞色素（MtrA）（Hartshorne et al.，2009；Ross et al.，2007）。MtrC则是一个胞外十血红素辅基细胞色素，作为这个复合体的终端。MtrF、MtrD与MtrE分别是MtrC、MtrA与MtrB的同源蛋白。操纵子mfrDEF在生物膜的生长中呈现出最高表达（McLean et al.，2008），但是会在MtrCAB和MtrFDE之间形成杂化复合体（Bücking et al.，2010；Coursolle and Gralnick，2010）。OmcA蛋白是MtrC和MtrF的同源蛋白，能够与MtrC或MtrF相互作用，从MtrCAB或MtrFDE复合体接受电子（Shi et al.，2006），也可以在ΔmtrC或ΔmtrF突变株中替代这些蛋白（Coursolle and Gralnick，2010）。

目前已经对其中外膜电子传递通道中的一种十血红素辅基细胞色素（MtrF）进行了X射线晶体结构解析。根据这个结构模型，可以研究不同类型的胞内电子传递或解析可能的胞内电子传递发生机制。MtrF晶体结构的解析第一次确定了10个血红素的空间排布构型，其中血红素以一种独特的交叉构型贯穿在四个结构域（Domains Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）中（Clarke et al.，2011）。这个结构可以为我们提供分子水平研究的可能性，用于分析胞外呼吸菌如何还原不溶性底物（如矿物）、可溶性底物（如黄素）以及与细胞表面不同氧化还原细胞色素终端之间形成的电子传递链（Clarke et al.，2011）。

根据MtrF的晶体结构，Richardson等（2012）提出了一种可能的外膜蛋白组成的电子传递通道复合体的分子结构，由MtrC、OmcA、MtrA与MtrB构成，其中MtrA是基于两个五血红素辅基NrfB单体末端相连组成的（Clarke et al.，2007），MtrC与MtrA嵌入孔蛋白的深度是未知的。目前实验方法还无法研究蛋白内沿着血红素组成的通道进行的电子传递，而高性能计算则可以从分子水平解析血红素分子之间电子传递的热力学和动力学性质（Breuer et al.，2014）。采用这些蛋白组成独特的分子机器进行长距离的电子传输，转移电子的距离可以超过100Å（1Å=10-10m，下同），这对于生物纳米技术设备的设计具有明显的科学意义。

虽然目前对于胞内电子传递过程已经有很充分的探索，但是对于该过程涉及的界面过程和控制因素仍然很不清楚，而计算化学可以为实验结果提供充分而有力的证明与解释，能够为实验研究提供有指导价值的成果。在电子传递过程中可以对电子给体分子与电子受体分子以及固相界面组成的体系进行量子化学计算（Vondrasek et al.，2005），可以获得体系分子的电子结构与几何结构信息，从而分析分子轨道能级、原子的电子密度分布、电子传递反应过程的热力学和动力学性质（Zeng et al.，2009）。自然体系中的电子传递过程一般发生在水溶液环境中，而分子动力学模拟可以构建较大的模型体系，以考虑真实环境体系中水溶液中近程水分子的影响，分析分子间作用力以及离子或分子在液体或固体中的扩散。通过有效的预测可以揭示其内在规律性。理论计算可以得到实验技术无法或者较难测定的物化性质。将计算模拟方法与精湛的实验技术有效结合，能够为研究提供更具优势的工具，加快研究成果的实际应用。

（2）胞外电子传递过程

微生物胞外呼吸菌将细胞代谢产生的电子从胞内传递到细胞外膜后，可以通过直接接触机制、纳米导线机制、应电运动机制和电子穿梭机制将电子转移给胞外电子受体（图1-1）。

实际环境介质中，各种微生物以群落形式存在，在它们所形成的代谢及呼吸网络中，上述各种电子传递机制将同时存在并相互协调。例如，非产电细菌可能会分泌某些电子穿梭体促进产电细菌的电子传递过程，而产电细菌的不完全代谢产物可能会为非产电细菌提供营养物质，细胞与细胞之间的纳米导线也可能会促使细胞之间发生电子传递。

图1-1中，①为好氧微生物的电子转移途径；②为硝酸盐呼吸菌和硫酸盐呼吸菌的电子转移途径；③～⑦为胞外呼吸菌的电子转移途径，其中③为胞外电子的直接接触传递方式，④为胞外电子的应电运动传递方式，⑤为胞外电子的纳米导线传递方式，⑥与⑦为胞外电子的电子穿梭体传递方式，⑥中的电子穿梭体在胞外环境介质中可移动，而⑦中的电子穿梭体在胞外环境介质中不可移动。

1）直接电子传递机制

直接电子传递机制是通过外膜上的活性蛋白将电子直接传递给电子受体，这类蛋白主要是末端还原酶和外膜表面黏性蛋白，目前研究发现希瓦氏菌属和地杆菌属多使用这种方式（Shi et al.，2006；Inoue et al.，2010）。微生物细胞外膜与电子受体的接触是直接电子传递的前提条件，也是其限速步骤，任何与接触蛋白有关的因子都会影响到直接电子传递的效率。直接电子传递机制与电子受体种类有关，例如，希瓦氏菌外膜终端还原蛋白OmcA或MtrC都可以还原核胞外的核黄素类物质促进产电，但在ΔmtrC突变株可以表现出与野生型相当的核黄素还原能力，由此认为OmcA在核黄素还原过程中起到主要作用（Coursolle and Gralnick，2010）。希瓦氏菌通过直接电子传递方式不仅可以将电子传递给可溶性的胞外电子受体，而且还可以传递给固相的胞外电子受体［例如Fe（Ⅲ）氧化物］，但与固相电子受体产生直接接触的外膜蛋白主要是MtrC（White et al.，2013）。同时，研究还发现，只要有连续的电子供应，微生物就完全能够在厌氧环境中通过直接接触固相铁矿物的方式维持生命（White et al.，2013）。理论上，在胞外直接电子传递的过程中会导致大量的胞外物质的产生，希瓦氏菌生物膜胞外物质主要以蛋白和多糖类等物质（Cao et al.，2011）为主，这些不导电物质的产生可能会阻碍生物膜细胞与电子受体的有效接触，从而抑制直接电子传递过程。此外，直接电子传递方式与细胞生物膜的形成也存在密切关系，希瓦氏菌的直接电子传递方式所必需的细胞外膜色素蛋白在生物膜的形成过程中会显著上调，其生物膜形成能力及其构成是影响直接电子传递的重要因素（Newton et al.，2009），也是一个容易被忽视的方面。

2）应电运动机制

某些微生物胞外呼吸菌可以将氧化底物所产生的电子储存在细胞表面，形成所谓的生物电容器，然后通过接触-传递的方式将电子转移给胞外电子受体，或者通过细胞鞭毛瞬间触及胞外电子受体的方式将电子释放，并迅速脱离电子受体表面，参与下次循环的电子传递。这种电子传递机制与电子穿梭机制有着明显的不同，无需电子穿梭体，是依靠微生物本身的应电运动方式传递电子。目前已经确定能够产生应电运动方式传递电子的微生物主要是希瓦氏菌，包括MR-1、SB2B与CN32，尤其是MR-1更为突出。研究发现，三种希瓦氏菌ΔmtrA、ΔmtrB与ΔcymA突变株都无法通过应电运动方式向胞外电子受体传递电子，这说明细胞外膜蛋白MtrA、MtrB与CymA在应电运动电子传递过程中是必不可少的部件。然而，并不是任何情况下都能够发生应电运动电子传递，合适的胞外电子受体才可以激发应电运动的发生，但这种应电运动又不同于微生物的趋药性和趋电性。研究表明，当MnO₂和微生物燃料电池的石墨电极作为胞外电子受体时，只能激发很少一部分的希瓦氏菌以应电运动方式进行传递电子，而当加入可溶性的胞外电子穿梭体（例如AQDS）后，以应电运动方式进行胞外电子传递的希瓦氏菌数目将大大增加，从而加速了MnO₂的还原和增加了微生物燃料电池的电流，这是由于在这种体系下希瓦氏菌首先是将电子以应电运动方式传递给电子穿梭体，然后再通过电子穿梭体传递给最终受体，而可溶性的电子穿梭体可能比固相的MnO₂和电极更能够激发应电运动的发生。不仅如此，可溶性的电子穿梭体也可以激发希瓦氏菌ΔmtrB突变株产生应电运动（Harris et al.，2009），但这与希瓦氏菌ΔmtrB突变株无法还原AQDS电子穿梭体（Lies et al.，2005）似乎是相矛盾的，关于其确切的原因目前还不甚清楚。

3）纳米导线机制

纳米导线（nanowire）电子转移机制最初是在地杆菌G.sulfurreducens中发现的，它是指一定条件下微生物形成类似菌毛的导电附属肢体，这种导电附属肢体被称为纳米导线（Reguera et al.，2005），其作为电子导管可远距离向胞外电子受体传递电子，从而克服了细胞表面无法与电子受体直接接触的问题。通常情况下，纳米导线的直径只有3～5nm，长度是直径的1000多倍，且非常耐用。除地杆菌之外，希瓦氏菌MR-1、光合蓝绿菌中集胞藻（Synechocysti）和喜温发酵菌（Pelotomaculum thermopropionicum）在一定条件下也可以产生纳米导线（Gorby et al.，2006），表明纳米导线不只是异化金属还原菌的专属物，而可能是细菌有效获得电子的共同策略（见图1-2）。希瓦氏菌纳米导线与地杆菌纳米导线在结构和组成上都存在差别，希瓦氏菌纳米导线呈电缆状，由多束更纤细的丝状物组成一股较粗的菌毛状结构，而地杆菌纳米导线则是呈单根状的表面附生结构，菌毛较细（Gorby et al.，2006）。然而，最近通过对希瓦氏菌MR-1活体细菌进行荧光测量、免疫标记以及定量基因表达分析，发现MR-1的纳米导线并非是之前一直认为的鞭毛结构，而是细胞外膜和周质的延伸，而且同样承载有CymA、MtrA、MtrB、MtrC和OmcA蛋白酶（Pirbadian et al.，2014）。

纳米导线可以进入土壤和沉积物的纳米孔隙，不仅有利于细胞吸附于不溶性电子受体表面，而且可以传递电子进行还原作用（Reguera et al.，2005）。原子力扫描隧道显微镜证明了纳米导线具有较强的导电性能（Reguera et al.，2005），最近研究显示细菌纳米导线传输电子可达厘米级范围，是细菌自身大小的数千倍（Malvankar et al.，2011），说明相对于其他电子传递方式，纳米导线具有更优良的导电性。纳米导线主要是通过类似金属导电的形式或通过细胞色素间电子跃迁的形式进行传输电子（Malvankar et al.，2012）。前人研究发现细胞外膜蛋白OmcA或MtrC缺陷型的希瓦氏菌仍然可以产生纳米导线类似结构，但不具有导电性（Gorby et al.，2006），表明OmcA或MtrC是希瓦氏菌纳米导线传递电子所必须的，但关于其具体作用目前尚不清楚，有可能是参与的细菌纳米导线的构成。研究发现培养于不溶性铁氧化物的G.sulfurreducens可产生纳米导线，而可溶性的铁溶液中却没有此现象（Reguera et al.，2005），这显示微生物纳米导线的产生是可控制的。Reguera等（2005）对编码纳米导线蛋白亚组的基因GSU1496 进行了检测实验，发现当缺乏该基因时，G.sulfurreducens就不能产生纳米导线且不再还原不溶性电子受体，由此可见，通过转基因技术及环境诱导，使微生物长出纳米导线是可能的。此外，细菌纳米导线的导电性能还与环境条件存在密切关系，尤其是温度，这可能是由于温度过高会导致纳米导线产生无序的结构（Malvankar et al.，2011）。

微生物纳米导线还可以促进微生物燃料电池产电以及生物膜的形成，甚至可能形成细胞与细胞之间的链接及电子传递网络。细菌纳米导线的发现改变了微生物控制电子传输的传统理解，有益于纳米电子技术的应用发展，今后可从遗传上修改细菌纳米导线结构或合成不同功能的纳米导线，应用于纳米电子设备、微生物燃料电池、能源污染处理、微环境传感器等领域（Malvankar and Lovley，2012，2014）。

4）金属配位体增溶机制

金属配位体增溶机制对于微生物异化金属是非常重要的。Fe（Ⅲ）氧化物可与许多螯合剂形成铁配位体，该配位体的存在：一是可以增加反应体系中Fe（Ⅲ）的生物可利用性；二是可以提高Fe（Ⅲ）与异化铁还原菌直接接触的概率，从而提高铁还原的速率。Arnold等（1988）在研究希瓦氏菌SP200还原赤铁矿的实验中发现，加入等浓度的氮三乙酸（NTA），铁矿物溶解速率可提高20倍。在腐殖质土壤中NTA促进Fe（Ⅲ）还原不是因为增溶铁，而是因为NTA的加入增加了从土壤腐殖质向水溶液中的溶解，进而通过溶解性的腐殖质作为电子穿梭体来加速铁（Ⅲ）还原。除NTA外，乙二胺四乙酸（EDTA）、乙醇二氨基乙酸（EDG）、六偏磷酸钠（Calgon）、甲基亚氨基二乙酸（MIDA）与多磷酸盐等螯合物也能够促进Fe（Ⅲ）氧化物的溶解及还原（Lovley et al.，1996）。同时，自然界中也存在多种铁螯合物，如麦芽糖醇与邻苯二酚等（Dobbin et al.，1999）。另外，有些微生物能分泌螯合物，如高铁载体（siderophores），它是微生物在缺铁的情况下分泌到细胞外的低分子量有机化合物，可与Fe（Ⅲ）进行配位而增溶铁。尽管上述这些螯合物改变了环境中铁的存在状态，促进了铁元素及其他元素的循环，但它们在环境中也可能受到其他物质或微生物的影响，使其作用力损耗，限制了对不溶性Fe（Ⅲ）的还原转化。

5）电子穿梭机制

上述各种电子传递方式只能在细胞与电子受体直接接触或者纳米级的距离内进行，而事实上，许多不溶性的电子受体的还原可在一定距离外进行，这暗示着微生物可以通过电子穿梭体物质还原不溶性电子受体。电子穿梭机制是指微生物利用自然环境中广泛存在的腐殖质、植物根系分泌物、或细胞自身合成的电子穿梭体（Lovley et al.，1996；Marsili et al.，2008；Okamoto et al.，2013），接受胞内传递出的电子，并将其运出细胞，传递给胞外电子受体后，以氧化态返回细胞再次接受电子，如此往返穿梭于细胞与电子受体之间的电子传递（图1-3）。

在环境中，细胞外的电子传递中介体被认为对可利用不溶性物质作为电子供体或受体的微生物是非常重要的（Watanabe et al.，2009）。一个典型实例是异化铁还原菌，尽管十几年前认为异化铁还原菌必须直接接触三价铁氧化物才能将它们作为电子受体，但实验证据已显示，无论是自然存在的、还是自身分泌合成的电子穿梭体，在细菌细胞和三价铁氧化物之间的长距离扩散上均可以通过电子转移而有效解决上述的局限性（Hernandez and Newman，2001；Nevin and Lovley，2002），甚至很低的电子穿梭体都会对已知环境中的末端氧化剂的电子转移产生显著的影响（Marsili et al.，2008）。此外，最近基于动力学的研究已经发现，诸如地杆菌Geobacter sulfurreducens之类的异化铁还原菌转运电子至电子穿梭体（如环境浓度的腐殖质）的速率远高于转运至固相氢氧化铁的速率（至少是27倍）（Jiang and Kappler，2008），由此表明电子穿梭体对于环境中异化铁还原菌的能量代谢具有重要意义。此外，基于电子穿梭体的电子转移过程在有机污染物生物修复、污水处理等环境治理方面也起到积极作用，例如胡敏酸作为常见的电子穿梭体，可以促进厌氧污泥高效去除苯酚和四氯化碳污染物（Martinez et al.，2013），核黄素通过促进电子传递可以加快环杂硝胺的降解。

（3）细胞间电子传递过程

微生物本质上来说并不会作为单纯的培养物存在，而是与邻近的细菌、古细菌及真核生物等共同参与各种相互作用和产生营养相互依赖性存在于生态系统中。微生物之间的互养共栖就是一种典型的营养相互依赖性的生存方式，其中两种或者多种微生物之间会组合新陈代谢的能力，以降解那些单个微生物所无法独立降解的特殊物质。两个微生物合作伙伴之间通过共享电子的互养共栖对于各种产甲烷环境的生态功能运转是非常重要的，例如在湿地、水中沉积物、储油池以及将有机垃圾转换成甲烷的厌氧分解池。微生物细胞间的电子传递被认为在微生物聚集体中起到了非常重要的作用，这些微生物聚集体可以通过还原硫酸盐的方式来厌氧氧化甲烷。

细胞间电子传递最著名的策略就是H₂细胞间电子传递体，其中供电子的微生物会将质子还原产生H₂，而产甲烷菌则通过氧化H₂将二氧化碳还原成甲烷。在某些情况下，甲酸盐会取代H₂作为细胞间电子传递体。在厌氧土壤、沉积物以及某些厌氧分解池中存在有丰富的依靠消耗H₂/甲酸盐生存的产甲烷菌，这表明H₂/甲酸盐细胞间电子传递体对于调控这些环境的甲烷生成起到了非常重要的作用。目前，在H₂供体微生物与H₂消耗产甲烷菌的混合培养研究中已经对H₂细胞间电子传递体做了详细描述，而且对H₂产生及H₂消耗的生理学与生物化学过程也有较深刻的理解。

另外一种代替H₂细胞间电子传递体的机制就是细胞间直接电子传递。甲烷丝状菌（Methanosaeta haurindacaea）是一种地球上最重要的产甲烷的微生物，其在混合培养中会直接接受来自地杆菌（Geobacter metallireducens）的电子，将二氧化碳还原成甲烷。有多个证据表明，甲烷丝状菌在处理啤酒厂垃圾的厌氧分解池中也会参与细胞间的直接电子传递；在分解池的颗粒中也富含地杆菌种，其拥有类似于金属的导电性能，这与地杆菌菌毛的导电性非常相似（Rotarua et al.，2014）。由此可见，在甲烷丝状菌和地杆菌混合培养中，地杆菌产生的菌毛在细胞间直接电子传递机制中起到十分关键的作用，其主要是通过生物膜上的氧化还原辅因子所形成的碳-碳连接结构进行多级电子跃迁，从而实现电子传递（Nagarajan et al.，2013）。

乙酸产甲烷菌中的甲烷八叠球菌（Methanosarcina）也具有细胞间直接电子传递机制，它在产甲烷土壤、沉积物、煤矿、垃圾填埋场及厌氧分解池中也都有广泛的分布（Hu et al.，2013）。研究表明，甲烷八叠球菌可以接受来自细胞外非生物表面体的电子（Kato et al.，2012），例如，甲烷八叠球菌（M.barkeri）会吸附到颗粒活性炭上接纳电子，这种颗粒活性炭可以作为M.barkeri与G.metallireducens之间电子传递的中介体（Liu et al.，2012）。缺乏菌毛或与菌毛有关的细胞色素OmcS的地杆菌G.sulfurreducens突变体是无法在没有颗粒活性炭的厌氧环境中进行细胞间直接电子传递，而在富含颗粒活性炭的情况下却可以很好地进行细胞间直接电子传递（Liu et al.，2012），表明颗粒活性炭在细胞间形成了电子流通道。

1.2.2.3　微生物胞外呼吸与铁（Ⅲ）还原

Fe（Ⅲ）可以被非生物还原，也可以被异化铁还原微生物还原。Fe（Ⅲ）的还原会耦合Fe、C与S等元素的循环，这几乎在自然界的所有环境中都会发生。

很多微生物都可以通过各类电子供体还原Fe（Ⅲ），如醋酸盐、乳酸盐和H₂。其中最常见Fe（Ⅲ）还原菌包括Geobacter spp.、Shewanella spp.、Albidoferax ferrireducens、Geothrix fermentans以及各类超嗜热古菌（Lovley and Phillips，1988；Lovley et al.，2011；Myers and Nealson，1990；Obuekwe et al.，1981；Ramana et al.，2009；Coates et al.，1999）。Geobacter spp.是第一个被证明能够通过短链脂肪酸、单环芳香化合物（如甲苯或者苯）或者氢作为电子供体的Fe（Ⅲ）还原菌（Lovley et al.，1987；Lovley et al.，2011；Zhang et al.，2013），将Fe（Ⅲ）矿物还原成含有混合价态的磁性矿物Fe₃O₄。

与发酵细菌一起，Geobacter spp.可以将有机碳完全矿化成CO₂，这在还原性环境中非常普遍（Lovley et al.，2011）。Geobacter spp.对由Fe（Ⅲ）矿物还原产生的Fe（Ⅱ）会表现出趋药性行为，并通过这种方式找到Fe（Ⅲ）矿物源，然后利用菌毛吸附在矿物表面上（Childers et al.，2002；Meth􀆧 et al.，2003）。除了还原Fe（Ⅲ）之外，Geobacter sulfurreducens还会在醋酸盐存在的情况下，将N还原成NH₃的过程与Fe（Ⅱ）氧化过程耦合在一起（Coby et al.，2011；Meth􀆧 et al.，2003）。

另外一种研究比较多的Fe（Ⅲ）还原菌是希瓦氏菌，尤其是S.oneidensis MR-1，它是于20世纪90年代被发现的（Myers and Nealson，1990），可以用氢、甲酸盐或者乳酸盐作为电子受体来还原Fe（Ⅲ）。

Shewanella spp.与Geobacter spp.的基因组序列信息有助于确定与Fe（Ⅲ）还原途径有关的基因（Heidelberg et al.，2002；Meth􀆧 et al.，2003）。来自细胞内分解代谢的电子会被转移到细胞局部表面的c型细胞色素上，这些细胞色素可以催化细胞外电子转移来还原Fe（Ⅲ）与Mn（Ⅳ）氧化物（Shi et al.，2009）。在S.oneidensis MR-1中，与外膜有关的c细胞色素MtrC、MtrF及OmcA被认为对绑定和还原Fe矿物都起作用（Donald et al.，2008；Reardon et al.，2010；Shi et al.，2009）。外膜细胞色素还会通过外膜乳蛋白-细胞色素复合物与细胞内醌池的呼吸电子之间建立联系，比如说MtrA、MtrB与CymA（White et al.，2013）。MtrA与MtrB的同系物在很多变形菌门的微生物中都可以得到系统发育性地继承保存，包括Shewanella、Geobacter与Rhodopseudomonas属（Hartshorne et al.，2009；Jiao and Newman，2007；Shi et al.，2012）。很多地杆菌属都会分泌细胞外细胞色素，例如G.sulfurreducens分泌的OmcS能够与导电性的菌毛纳米导线结合，从而可以调节纳米导线上电流的传导，或者作为还原Fe（Ⅲ）矿物的接触点（Qian et al.，2010；Leang et al.，2010；Malvankar et al.，2011）。除了细胞色素之外，G.sulfurreducens还需要外膜乳蛋白OmpJ用于Fe（Ⅲ）的还原（Afkar et al.，2005）。尽管S.oneidensis与G.sulfurreducens在电子传输途径上含有相类似的元件，但它们的功能是完全不同的（Shi et al.，2007）。此外，不同的Geobacter菌种似乎具有不同的细胞色素附件（Butler et al.，2010），这说明Fe（Ⅲ）还原所必需的电子转移可以通过各种不同的生物化学途径来实现。

由于Fe（Ⅲ）氢氧化物的溶解性很差，并且细胞色素之间电子能够“跃迁”的最大距离只有2.0 nm（Gray and Winkler，2009），因此，理解Fe（Ⅲ）矿物的微生物还原一般都会涉及电子从微生物细胞向外转移到Fe（Ⅲ）矿物的策略，而不仅仅是细胞-矿物直接接触的策略（Hernandez and Newman，2001）。目前，有几种机制可以被用来解释电子从细胞转移到胞外固体表面的过程，这几种机制可以在微米、毫米甚至厘米级的距离上进行电子传输（Hernandez and Newman，2001；Nielsen et al.，2010；Shi et al.，2012）。在低Fe（Ⅲ）环境下，希瓦氏菌S.oneidensis会分泌具有氧化还原活性的电子穿梭体（例如黄素），搭建细胞与Fe（Ⅲ）矿物之间的电子传输（Marsili et al.，2008；von Canstein et al.，2008），或者利用Fe（Ⅲ）螯合剂，进而促进Fe（Ⅲ）作为电子受体（Nevin and Lovley，2002）。在Shewanella与Geobacter的胞外电子转移中还会牵涉具有氧化还原活性的菌毛纳米导线的产生（Gorby et al.，2006；Reguera et al.，2005）。此外，Shewanella与Geobacter物种也会通过外源的电子穿梭体的策略将电子转移到远离细胞所在位置的Fe（Ⅲ）矿物上（Lies et al.，2005；Rosso et al.，2003），这种电子穿梭体也是一种具有氧化还原活性的分子成分，例如硫化合物和腐殖质等天然有机物（Lohmayer et al.，2014）。

溶解性与固相腐殖质都可以刺激Fe（Ⅲ）矿物的微生物还原（Lovley et al.，1996；Roden et al.，2010）。该过程的第一步会牵涉微生物将电子供给腐殖质（包括胡敏酸和富里酸），第二步是还原的腐殖质通过非生物电子供给的方式将电子传递给Fe（Ⅲ）矿物。腐殖质的这种能力不只限于异化金属还原菌，湖泊与海洋沉积物以及无污染与被污染的湿地沉积物中的发酵细菌、产甲烷菌和硫酸盐还原菌也都具有将电子传递给腐殖质的能力（Benz et al.，1998；Cervantes et al.，2002）。因此，在无法采用微生物酶来直接还原Fe（Ⅲ）的情况下，基于腐殖质作为电子穿梭体的Fe（Ⅲ）非生物还原是一种促进生物地球化学铁循环的重要途径（Piepenbrock et al.，2014）。

在很多情况下，硫化合物可以从微生物膜传递出的电子，然后来实现Fe（Ⅲ）矿物的还原（Yao and Millero，1996）。在中性pH下，微生物还原后产生的H₂S可以通过非生物的方式来还原Fe（Ⅲ）氧化物，其还原速率取决于矿物质表面积以及pH值，而且还原速率还会与H₂S及Fe（Ⅲ）氧化物浓度之间表现出一阶动力学关系（Yao and Millero，1996）。在海洋环境中，高浓度的硫酸盐和元素硫的微生物还原会产生大量的H₂S，在这种情况下，H₂S与Fe之间的反应是非常重要的，因为该反应过程会将挥发性的H₂S形成沉淀形式的硫单质。因此，在某种程度上来说，铁矿物可以通过防止H₂S从沉积物中挥发到上覆水中的方式来控制H₂S的分布（Canfield，1989；Thamdrup et al.，1994）。

1.2.2.4　微生物胞外呼吸在环境污染修复中的应用

人类活动产生的有机和无机污染物造成了大量环境问题。多数情况下，污染物的行为是由复杂的生物地球化学过程控制，而微生物群落则可以调节这些生物地球化学过程。胞外呼吸菌，尤其是异化金属还原菌，其胞外电子传递过程是最近新发现的新型微生物厌氧能量代谢方式，它作为一种独特的氧化还原过程，在污染物原位修复、污水处理以及清洁生物能源提取方面已经逐渐呈现出不可替代的优越性和重要的应用前景，因此近几年来受到科学界的广泛关注。

（1）有机污染物的氧化与还原降解

人类活动产生的有机物污染物通常含有芳香族化合物，而苯环的热稳定性就使得这些污染物难以转化，长期存留于环境中（Carmona and Díaz，2005）。大量有机物电子供体的异化作用会把氧气作为电子受体而迅速消耗掉，从而形成厌氧环境（Carmona et al.，2009），这为Fe（Ⅲ）氧化物作为电子受体参与有机物的氧化提供了主要场所。经过对环境的现场检测已证明，Fe（Ⅲ）还原时会促进有机物降解（Lyngkilde and Christensen，1992；Nielsen et al.，1995；Christensen et al.，2001）。最先被发现的能够将Fe（Ⅲ）还原同时又可氧化芳香族化合物的单一菌属是异化金属地杆菌属G.metallireducens（Lovley et al.，1989），这一菌属是从烃类污染土壤中分离出来的，它可以利用Fe（Ⅲ）当作电子受体，从苯甲酸酯、甲苯、苯酚和对甲苯酚的氧化过程中获得能量（Lovley and Lonergan，1990）。它还能够将芳香族化合物矿化，产生CO₂，并产生极少的中间产物。对于硫还原地杆菌的基因组的研究，读者可参考Wischgoll 等（2005）和Carmona等（2009）的研究。迄今为止还没有研究显示地杆菌属某单一菌株能够将Fe（Ⅲ）还原并氧化芳香族化合物（Butler et al.，2007），但仍有发现Geobacter hydrogenophilus和 Geobacter grbiciae两种地杆菌同时存在时，两者均可以将苯甲酸盐氧化，后者甚至还可以氧化甲苯（Coates et al.，2001）。对剔除了地杆菌属基因后的细菌进行纯培养时，没有发现其他菌属具有将Fe（Ⅲ）还原并与芳烃氧化耦合的能力。最新的研究又分离出了两种带有这种新陈代谢特性的细菌，分别是Geobacter toluenoxydans和Desulfitobacterium aromaticivoran，其中后者是属于革兰氏阳性梭状芽孢杆菌（Kunapuli et al.，2010）。

虽然目前发现的地杆菌属能够将Fe（Ⅲ）还原并与芳香族化合物氧化耦合的并不多，但在沉积环境中确实有丰富的地杆菌，而且其中大部分都具有Fe（Ⅲ）还原能力，说明这一研究还是有其环境意义的（Coates et al.，1996）。利用16S rDNA序列分析等微生物生态学技术，发现这些地杆菌对芳烃污染的土壤修复意义重大（Rooney-Varga et al.，1999；Roling et al.，2001；Staats et al.，2011；Snoeyenbos-West et al.，2000），说明利用这些细菌进行生物强化来促进生物降解，制定一个较好的生物修复方案是可行的。然而，目前存在的主要问题是，微生物如何接触到固态的铁氧化物（Lovley et al.，1994；Lovley et al.，1996）。Fe（Ⅲ）还原与芳烃氧化耦合的过程会产生活性较强的Fe（Ⅱ），例如最新的研究表明，地杆菌属G.metallireducens氧化BTEX（苯、甲苯、乙苯和二甲苯）时所产生的Fe（Ⅱ），可以进一步介导酶污染物和硝基化合物的还原（Tobler et al.，2007），这表明，微生物还原Fe（Ⅲ）与芳烃氧化耦合过程可以将那些微生物无法直接利用的共存污染物进行降解（Tobler et al.，2007）。

如上所述，微生物还原Fe（Ⅲ）产生的Fe（Ⅱ）可以通过非生物电子交换反应还原转换污染物。事实上，在工业生产以及污染物的化学修复中，Fe（Ⅱ）是很常用的还原剂（Charlet et al.，1998）。生物Fe（Ⅱ）通常是由含铁的生物矿物产生，这些Fe（Ⅱ）或是存在于矿物结构中，或是吸附在矿物表面（Cutting et al.，2009）。已有实验证明，Fe（Ⅱ）矿物参与了六氯乙烷的脱卤和硝基氯苯的硝基还原（Elsner et al.，2004），还发现随着铁（Ⅱ）矿物成分不同，矿物表面的反应速率也不同，其中，铁硫化合物较其他矿物反应速率会比较大。在地下环境系统中，磁铁矿［也是由微生物还原Fe（Ⅲ）产生的］是一种很常见的物质，它能与污染物发生反应，这已经引起了许多关注（Gorski and Scherer，2009；Gorski et al.，2010）。Gorski等（2010）还发现，当磁铁矿中Fe（Ⅱ）的含量增加，硝基苯反应速率和铁矿合成的反应速率都会加快。McCormick和Adriaens（2004）将磁铁矿应用到了CCl₄的转化中，发现反应过程中约有47%的CCl₄经过脱卤反应转化成了CO₂和CH₄，但是关于CH₄的产生机理尚不明确。生物磁铁矿与微量的菱铁矿或某种含Fe（Ⅱ）物质相结合可以促进地下水中环三亚甲基三硝胺（RDX）的转化，虽然生成量只占反应物的30%，但却不断有亚硝基的生成，并最终导致1，3，5-三甲基己羟基-1，3，5-三嗪的积累（Williams et al.，2005）。Borch等（2005）把纤维菌Cellulomonas sp.放在含TNT的基质中培养，并加入水铁矿与电子穿梭体AQDS，实验结果发现，基质中迅速产生了TNT还原产物，而且这些产物比亲体分子更不易移动。

（2）重金属的还原转化

1）Cr（Ⅵ）的还原

Cr的氧化还原活性很强，环境中主要以Cr（Ⅵ）和Cr（Ⅲ）两种价态存在。在酸性和中性条件下，主要以Cr（Ⅲ）的形态存在，而在碱性和氧化性环境中主要以Cr（Ⅵ）的形态存在（Kimbrough et al.，1999）。环境中Cr（Ⅲ）主要以铬氧化物的形式存在，通常与铁结合形成铬铁矿或吸附在矿物表面，只有在酸性很强的条件下才能够被溶解（Fendorf，1995）。Cr（Ⅵ）的存在形式有很多，主要有H₂CrO₄、HCr、Cr和Cr₂等，都是易溶物且不易吸附在矿物表面（Kimbrough et al.，1999）。

Cr（Ⅵ）是有毒的（Chen and Hao，1998），而Cr（Ⅲ）没有毒性，还是糖脂代谢必需的营养物质（Wang，2000）。传统的处理Cr（Ⅵ）污染物的方法就是化学还原为Cr（Ⅲ）氧化物，然后沉淀去除。由于Cr（Ⅵ）/Cr（Ⅲ）氧化还原电位较高，溶解氧对Cr（Ⅲ）的再氧化在动力学上是非常缓慢的（Rai et al.，1989）。尽管水体和土壤中存在锰氧化物可以再氧化Cr（Ⅲ），但这是一个溶解控制过程，且进行得缓慢（Rai et al.，1989）。

虽然微生物可以通过胞外呼吸途径产生Fe（Ⅱ）或硫化物来间接促进Cr（Ⅵ）的还原，但研究发现微生物也可以通过直接电子传递方式来还原Cr（Ⅵ）。假单胞菌Pseudomonas dechromaticen和Pseudomonas chromatophila是最早被发现具有独自进行酶催化还原Cr（Ⅵ）的能力（Romanenko and Koren’kov，1977；Lebedeva and Lialikova，1979），随着不断地研究，发现了更多的有此特性的细菌（Cervantes et al.，2007），大多为兼性厌氧菌。早期的研究普遍认为，细菌还原Cr（Ⅵ）的过程没有能量的存储（Ishibashi et al.，1990），但随后就有研究指出，细菌在还原Cr（Ⅵ）的过程中也在不断地生长（Tebo and Obraztsova，1998；Francis et al.，2000）。此外，一些从土壤和水体中分离出的真菌也具有还原Cr（Ⅵ）的能力，例如Aspergillus sp.N₂、Penicillium sp.N₃、Hypocrea tawa与Paecilomyces lilacinus（Barrera-Díaz et al.，2012）。

Cr（Ⅵ）的微生物还原机制因酶在胞内位置的不同而异（Cervantes et al.，2007）。细胞膜上的Cr（Ⅵ）还原与呼吸链及相关的细胞色素有关，然而细胞质中的Cr（Ⅵ）还原与黄素还原酶有关（Magnuson et al.，2010）。在厌氧环境中，假单胞菌Pseudomonas ambigua G-1和Pseudomonas putida以NAD（P）H为电子供体，通过溶解Cr（Ⅵ）还原酶将Cr（Ⅵ）还原。正是基于这些实验研究，人们发现了越来越多溶解Cr（Ⅵ）还原酶也能够还原Cr（Ⅵ），如ChrR和NfsA（Ackerley et al.，2004；Barak et al.，2006）。不同的酶其还原机制不同，NfsA在还原Cr（Ⅵ）时有两个电子转移（Ackerley et al.，2004），产生的中间产物Cr（Ⅴ）会加快反应进行，而且反应生成的活性氧物质（ROS）与Cr（Ⅵ）的毒性有关（Barak et al.，2006）。经过Pseudomonas aeruginosa还原Cr（Ⅵ）的蛋白质组学研究，发现ROS解毒蛋白的过表达产物确实能降低Cr（Ⅵ）的毒性（Kilic et al.，2009）。大肠杆菌的可溶性还原酶ChrR在氧化还原反应过程中有4个电子转换，其中，3个电子用于将Cr（Ⅵ）还原为Cr（Ⅲ），还有1个电子传递到了分子氧，由此限制了ROS的产生（Ackerley et al.，2004）。

一些专性厌氧菌还原Cr（Ⅵ）时会把Cr（Ⅵ）当作电子受体。硫酸盐还原细菌是受到较多关注的微生物，因为它既能氧化乳酸又能还原Cr（Ⅵ），这与其还原硫酸盐和铬酸盐机理相似（Lloyd et al.，2001）。硫酸盐还原细菌Desulfovibrio spp.可以把氢气作为电子供体，利用c-细胞色素与氢化酶将Cr（Ⅵ）还原（Lovley and Phillips，1994）。在电子转移过程中，希瓦氏菌S.oneidensis可以利用MtrC和OmcA两种细胞色素作为终端还原酶将胞外Cr（Ⅵ）还原（Belchik et al.，2011），而当去除相应的mtrC和omcA两组基因后，细菌则不再还原Cr（Ⅵ），同时胞内Cr（Ⅲ）积累增加，胞外Cr（Ⅲ）减少（Belchik et al.，2011）。

将微生物对Cr（Ⅵ）的还原最终应用于微生物修复当中才是研究的目的。异位修复和污水处理系统的生物反应器均已实现了Cr（Ⅵ）的还原，这是由浮游细菌（Tripathi，2002）或是固定床生物膜上的细菌完成的（Konovalova et al.，2003）。Tripathi（2002）利用模式微生物P.aeruginosa A2Chr研究不同的生物反应器对Cr（Ⅵ）的还原，实验得知，与浮游细菌相比，固定床生物膜上的细菌不易受到Cr（Ⅵ）毒性的影响，因此可以应用于高浓度的Cr（Ⅵ）污染环境中。在固定床生物膜上接种Bacillus spp.（Chirwa and Wang，1997）、硫酸盐还原菌（Smith，2001）或是混合接种（Nancharaiah et al.，2010）等研究都证实了以上结论，且在好氧和厌氧环境下都适用，但是，在缺氧状态下细菌对Cr（Ⅵ）的去除能力更强。

Cr（Ⅵ）污染的原位处理也是一项重要的技术，土壤或沉积物中都有土著Cr（Ⅵ）还原菌（Bader et al.，1999）。通过各种不同的手段刺激细菌的代谢，例如，向电镀污染土壤中添加大豆胰蛋白酶、葡萄糖和矿物盐，发现细菌不仅还原了Cr（Ⅵ），而且还刺激了二氧化碳转化（Turick et al.，1998）。由于原位试验的环境条件不易控制，因此微生物代谢活动经常不会处于最佳状态，就大多数地下含水层来说，通常温度较低且电子供体有限。极端的酸碱度也是影响Cr（Ⅵ）污染原位处理的重要因素，因为Cr（Ⅵ）主要存在于碱性环境中。最近，很多实验研究从碱性环境中分离出了适应高pH值（通常pH 9～10）的Cr（Ⅵ）还原细菌，如Alkaliphilus metalliredigens（QYMF）（Roh et al.，2007），Burkholderia cepacia MCMB-821（Wani et al.，2007）和Halomonas sp.（Vanengelen et al.，2008）。对从不同的受Cr（Ⅵ）污染的样品中分离出的Cr（Ⅵ）还原细菌进行混合培养（Jeyasingh and Philip，2005；Jeyasingh et al.，2010），发现混合培养的Cr（Ⅵ）还原细菌能够将Cr（Ⅵ）完全还原。

2）汞的还原

汞的毒性取决于其价态，Hg（Ⅱ）毒性最强，Hg（0）毒性相对较小（Clarkson，1997）。受到最大关注的是甲基汞，这并不是因为细胞内的甲基汞进行脱甲基反应能生成有毒的Hg（Ⅱ），而是因为甲基汞更易移动（Morel et al.，1998）。

尽管自然界中汞的存在形态及其水平与许多化学过程有关（Jonsson et al.，2014；Zheng et al.，2013），但很多情况下降低或消除汞的毒性以及汞形态的转化都是通过微生物进行的（Hu et al.，2013；Schaefer and Morel，2009）。汞的剧毒性以及自然汞事件的频频发生使得许多细菌形成了一套能够解毒Hg（Ⅱ）的机制，包括细胞对Hg（Ⅱ）的吸收，胞内Hg（Ⅱ）被还原为毒性较小的Hg（0），最后基于高蒸气压和Hg（0）低溶解度被排出胞外（Barkay et al.，2005）。Hg（Ⅱ）是通过主动运输进入细胞，这一过程需要一系列特定的蛋白参与，包括周质蛋白MerP和细胞质膜蛋白MerT、MerC、MerF和MerE（Barkay et al.，2003）。一旦Hg（Ⅱ）进入到细胞内，就可以通过氧化还原中介体（谷胱甘肽、半胱氨酸）或直接与蛋白酶MerA结合（Barkay et al.，2003）。蛋白酶MerA是一种醌氧化还原酶，可将Hg（Ⅱ）还原为Hg（0），然后经被动扩散把Hg（0）运到细胞外（Barkay et al.，2003）。在厌氧环境中，被胡敏酸还原菌还原后的胡敏酸可以明显促进Hg（Ⅱ）的还原（Gu et al.，2011），说明Hg（Ⅱ）的还原会受到胞外呼吸过程的影响。

微生物对汞的解毒作用已经在污水处理试验（Wagner-Döbler，2003）和水、土壤及沉积环境的原位修复中得到了应用（Saouter et al.，1995；Nakamura et al.，1999）。在处理氯碱电解废水中，利用固定床生物反应器将污水中的Hg（Ⅱ）还原为Hg（0），然后反应器上密布的惰性载体（如浮石）和炭层过滤器会把流经过的Hg（0）吸附并固定（Wagner-Döbler，2003）。这种生物反应器上接种有耐汞微生物，主要是假单胞菌，这些细菌组成了一个厚的细胞生物膜和胞外多糖组织（Wagner-Döbler et al.，2000）。

汞污染土壤的原位生物修复也是一个重要的技术。Saouter等（1995）从Hg（Ⅱ）污染的湖泊中分离出耐汞微生物Aeromonas hydrophila KT20并进行接种培养，结果发现Hg（0）生成量有所增加。解毒蛋白mer的过度表达也有可能提高微生物对Hg（Ⅱ）的去除效率（Brim et al.，2000），但不幸的是转基因微生物不能轻易的应用到环境中去（Lloyd et al.，2003）。Brim等（2000）还对防辐射细菌Deinococcus radiodurans展开了基因工程研究，并将其应用于修复放射性核素和汞污染的环境，这一菌株中带有克隆的耐汞基因merA，即使在强辐射环境中也能够将Hg（Ⅱ）还原为Hg（0）。此外，某些金属还原细菌以及各种硫酸盐还原细菌（King et al.，2000）也能代谢产生甲基汞，而且这还是缺氧沉积物中甲基汞的主要来源。

3）铀的还原

U在环境中主要以U（Ⅳ）和U（Ⅵ）氧化物的形式存在。U（Ⅳ）氧化物可溶性差，而U（Ⅵ）碳酸盐复合物的可溶性很强，如UO₂（CO₃和UO₂（CO₃（Clark et al.，1995）。将铀还原可实现铀的固定（Williams et al.，2013），这是一种重要的污染修复机制，能够防止U（Ⅵ）迁移到地下水系统。

普遍认为在厌氧环境中铀的去除是一种间接还原，而且会牵涉许多微生物胞外呼吸的过程（Newsome et al.，2014）。例如，Lovley等（1991）认为，微生物会产生Fe（Ⅱ）或硫化物等还原剂将铀还原。他们还用醋酸盐和H₂作为电子供体，研究异化金属还原菌G.metallireducens和S.oneidensis对铀的还原，发现两种菌直接催化还原U（Ⅵ）的同时自身也在进行代谢生长。紧接着，又有学者通过培养硫酸盐还原菌D.desulfuricans和D.vulgaris，也得出了与上述相类似的结论（Lovley and Phillips，1992；Lovley et al.，1993）。尽管在实验中硫酸盐还原菌无法储存生长所需的能量，但U（Ⅵ）确实被迅速的还原为U（Ⅳ）。最近研究表明，在电子供体碳源供应充足的情况下，U（Ⅵ）的微生物还原与微生物量存在密切关系（Barlett et al.，2012a），地杆菌与硫酸盐还原菌对还原U（Ⅵ）不存在竞争关系（Barlett et al.，2012b），表明两种菌对还原U（Ⅵ）存在两种相互独立的机制。但无论如何，U（Ⅵ）的微生物还原速率比非生物还原要快，这暗示着微生物还原U（Ⅵ）可以被应用到环境污染修复中去（Holmes et al.，2015）。研究发现，微生物D.vulgaris在还原U（Ⅵ）的过程中，c3细胞色素起到了关键作用，这与Cr（Ⅵ）的微生物还原机理相似，而当用阳离子交换柱把电子传递蛋白从细胞的可溶性部分移除后，发现微生物就失去了还原能力（Lovley et al.，1993）。地杆菌G.sulfurreducens还原U（Ⅵ）的机理相对较复杂，因为在其细胞中有许多细胞色素，细胞周质（Lloyd et al.，2002）和细胞外膜（Shelobolina et al.，2007）中都有细胞色素，而且，最新研究还发现，胞外纳米导线也参与了G.sulfurreducens对U（Ⅵ）的还原（Cologgi et al.，2011）。Jeon等（2004）用多种天然Fe（Ⅲ）氧化物、合成Fe（Ⅲ）氧化物探究其对G.sulfurreducens还原U（Ⅵ）影响，结果发现，有天然Fe（Ⅲ）氧化物参与时，U（Ⅵ）的还原速率大大降低了，这表明，在近中性环境中，水体中U（Ⅵ）可被还原去除，但在非还原性条件下，随时间增长，会发生吸附解除（Ortiz-Bernad et al.，2004）。

Finneran等（2002）在新墨西哥州的一个铀矿渣堆附近采集沉积物和水进行试验，发现在厌氧条件下添加醋酸或葡萄糖可以加速U（Ⅵ）还原，15d内溶解性U（Ⅵ）浓度从10μmol/L降到1μmol/L以下。这一现象主要是由于微生物蛋白酶还原作用的结果，非生物还原剂Fe（Ⅱ）、硫化物和AQDS的添加并没有对U（Ⅵ）的还原起到任何贡献。在原位生物修复中，以乙醇作为电子供体时U（Ⅵ）的还原速率比添加其他电子供体时要快（Wu et al.，2006）。同样针对科罗拉多州的一个铀矿加工厂的铀污染，Anderson等（2003）侧重于含水层的U（Ⅵ）污染修复，对15个监测井的顺梯度和控制井的反梯度进行了评估。结果发现，连续9d添加醋酸后，某些井中水溶性U（Ⅵ）的浓度从0.6～1.2μmol/L降低到0.18μmol/L，而且Fe（Ⅱ）含量呈现出增加趋势。但50d之后，U（Ⅵ）的浓度又开始增加，Fe（Ⅱ）含量也开始降低。这一实验说明，大部分生物质和地杆菌细胞对U（Ⅵ）污染修复与Fe（Ⅱ）的产生存在关联。Anderson等（2003）推测，地杆菌主要负责U（Ⅵ）和Fe（Ⅲ）的催化还原，而后来U（Ⅵ）浓度的再次升高是因为在实验点硫酸盐还原菌进行硫酸盐还原的活动占了主导作用。Vrionis等（2005）对U（Ⅵ）和Fe（Ⅲ）的催化还原效率最高的区域内生长的地杆菌进行16S rRNA基因序列分析，发现有一种菌的基因组序列编码与地杆菌Geobacter bemidjiensis最相符，并在实验前期占主导地位，而其他菌与地杆菌Geobacter lovleyi相符，但这些菌在实验后期占主导地位。这些实验现象说明了U（Ⅵ）原位生物修复的复杂性，并且也提示我们应该如何有效实施长时间的U（Ⅵ）原位生物修复。

1.2.3　电子穿梭体——微生物胞外呼吸的“催化剂”

电子穿梭体（electron shuttle）是具有氧化还原活性的化学物质，其主要功能是促进微生物胞外电子传递。一种优良的电子穿梭体应具备如下物理化学性质：a.电子穿梭体的氧化还原电位要在电子受体和电子供体的氧化还原电位之间；b.电子穿梭体具有较好的氧化还原特性，能够实现氧化态和还原态之间的快速转换；c.电子穿梭体结构稳定，且不参与细胞内的代谢过程；d.电子穿梭体不容易被细胞和电子受体吸附，具有一定的可溶性或导电性。电子穿梭体根据其来源不同可以分为人造电子穿梭体、天然电子穿梭体和内源性电子穿梭体。

1.2.3.1　人造电子穿梭体

人造电子穿梭体在生物电化学工程中的应用较多，常常在没有电活性微生物的条件下用来尝试降解复杂的底物。人造电子穿梭体降低了电子传递产生的过电势，并且能透过细菌生物膜获得电子。蒽醌-2，6-二磺酸盐（AQDS）是目前最常见的人造电子穿梭体，其常被作为电子转移机制研究中的模式电子穿梭体，它不仅能够促使微生物持续产电，而且对于重金属和有机污染物的微生物转化过程具有重要的促进作用（Van der Zee and Cervantes，2009）。人造电子穿梭体在酵母微生物燃料电池中也是必不可少的，因为电子传递链位于细胞质线粒体中，而且通常情况下，像Saccharomices cerevisiae这样的酵母不能产生内源性电子穿梭体。在一些电化学电池中，微生物细胞很难维持细胞活性，但引入人造电子穿梭体甲基紫精（methyl viologen），可以有效地将电子传递至微生物，使这类微生物可以在溶液中进行呼吸作用。

1.2.3.2　天然电子穿梭体

天然电子穿梭体主要包括腐殖质、半胱氨酸、生物炭、S0/HS-电对、中性红、亚甲基蓝等。

半胱氨酸在自然界中较常见，它是一种含有巯基的氨基酸，是血红素蛋白、铁氧化还原蛋白和红素氧还蛋白等蛋白参与电子传递的必需氨基酸，也是一种微生物生长基质中普遍采用的还原剂。Kaden等（2002）发现，Geobacter sulfurreducens和Wolinella succinogenes共培养过程中半胱氨酸能够在种间传递电子。此外，在纯培养的Geobacter sulfurreducens中加入半胱氨酸可使胞外还原速率增加8～11倍。相比于普通的、可以形成未定Fe（Ⅲ）复合物的配位剂，半胱氨酸可以作为一种电子穿梭体增加微生物还原铁的速率（Doong and Schink，2002；Liu et al.，2012）。此外，半胱氨酸作为电子穿梭体还可以间接提高微生物燃料电池的效能。

生物炭是由生物残体在缺氧情况下经高温慢热解产生的一类富含芳香性和醌类结构的物质，其具有很强的氧化还原活性（Klüpfel et al.，2014），而且能够参与环境中许多非生物过程的氧化还原反应。基于电化学方法的研究表明，每克生物炭能够接受和供给数百摩尔电子，其具体数值因生物炭来源和炭化温度的不同而异（Klüpfel et al.，2014）。实际上，生物炭不仅能够参与和促进非生物的氧化还原过程，而且在微生物介导的氧化还原过程中也具有重要作用。Kappler等（2014）的研究表明，生物炭在5～10g/L的浓度下对于希瓦氏菌（Shewanella oneidensis MR-1）还原水铁矿的反应速率和反应程度均具有明显的促进作用，但过低的生物炭浓度（<1g/L）则对水铁矿的微生物还原起反作用，由此表明合适浓度的生物炭在微生物胞外电子传递过程中具有重要的电子穿梭体功能。进一步的控制实验发现，生物炭之所以具有很强的电子穿梭体的功能并不是因为生物炭中可溶性部分的有机结构在起作用，而与生物炭本身的微粒性质有关（Kappler et al.，2014）。然而，这个研究只是在实验室模拟中进行的，而在实际土壤等环境介质中，生物炭在矿物-微生物-生物炭联合形成的网络结构中是否还能够发挥以及能够多大程度发挥电子穿梭体的功能还有待于进一步探索。

硫是影响铁的生物地球化学氧化还原过程的重要因素，特别是还原态的硫与铁的反应活性更高（Lohmayer et al.，2014）。H₂S可导致Fe（Ⅲ）氧化物发生化学还原溶解（Afonso and Stumm，1992），并伴随着Fe（Ⅲ）氧化物表面吸附物质的释放。然而，H₂S并不一定是导致Fe（Ⅲ）氧化物还原必须存在的形态。很多硫还原细菌可以使用不同的氧化态硫作为电子受体，形成硫化物，从而促进Fe（Ⅲ）化学还原的发生和提高砷的移动性（Burton et al.，2013）。在硫代硫酸盐浓度较低时，硫还原细菌Sulfurospirillum deleyianum可以将甲酸盐氧化成CO₂，并伴随着Fe（Ⅲ）还原成Fe（Ⅱ），由此推测氧化态硫与其相应的还原态硫构成的氧化还原电对可以很好充当电子穿梭体的角色。然而，目前还没有鉴别电子传递至Fe（Ⅲ）这一过程中氧化形成的硫化合物，但是它们可能是硫或者硫代硫酸盐。在碱性环境中，S0/HS-电对作为电子穿梭体可以明显促进微生物还原Fe（Ⅲ）氧化物（Flynn et al.，2014），表明异化铁还原菌与硫的微生物还原过程存在密切联系（Friedrich and Finster，2014）。在三氯乙酸被还原为二氯乙酸的还原脱氯过程中，人们也评估了S0/S2-电对作为电子传递中介体所起的作用（de Wever et al.，2000）。另外，在缺氧呼吸过程中还发现了其他氧化还原电对可以作为电子穿梭体，如CO₂/甲酸、2H+/H₂、N/N、MnO₂/Mn2+（Schröder，2007）。

1.2.3.3　内源性电子穿梭体

内源性电子穿梭体是微生物为了适应某种环境条件而分泌合成的有机化合物，目前已经发现的内源性电子穿梭体主要有黄素、吩嗪类物质、黑色素、苯醌类物质等。

（1）黄素

黄素分子主要以黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）和黄素单核苷酸（FMN）两种形式存在，它们能够催化细菌内部氧化还原反应。其中核黄素是FAD和FMN主要的氧化还原部分（Tan et al.，2012）。von Canstein等（2008）研究得出，很多Shewanella oneidensis能利用核黄素来介导不溶性三价铁氧化物还原。Marsili等（2008）确证了Shewanella oneidensis MR-1和Shewanella oneidensis MR-4在序批式培养过程中能积累250～500 nmol/L的黄素，并且以这些黄素为可溶性电子传递中介体将胞外电子传递至处于氧化电势的电极。在bfe基因（负责FAD运输）缺陷型Shewanella oneidensis MR-1突变株的培养液中没有检测到黄素的存在，该突变株还原不溶性电子受体的能力也相应缺失，但向培养液中补充黄素后可以弥补这种还原能力的缺失；通过检测Fe（Ⅱ）含量和电流大小证明了黄素对电子转移能力的贡献率可达75%，表明基于黄素介导的间接电子传递机制在整个电子转移过程中起到重要作用。Shewanella oneidensis MR-1自身分泌的黄素作为外膜蛋白传导电子的氧化还原辅因子，提高了OM c-Cyt转移电子的能力（Okamoto et al.，2013）。全细胞的差示脉冲伏安法显示黄素的氧化还原电位可逆地向正向移动了多于100 mV，这与微生物产电增加的现象是相符的。更重要的是，试验结果表明，黄素/OM c-Cyt之间的相互作用是加速了通过半醌发生的一电子（one-electron）氧化还原反应，且反应速率相比于黄素的单独作用快了103～105倍。这个机理虽然与之前描述的氧化还原媒介参与的电子传递机制不同，但是黄素/OM c-Cyt的相互作用同时调节了胞外电子传递的程度以及胞内代谢活动。

（2）吩嗪类物质

吩嗪类物质是γ变形细菌Pseudomonas sp.分泌的一类次生代谢物，功能基团是杂环结构，主要包括绿脓菌素、1-甲酰胺吩嗪、1-羟基吩嗪。吩嗪类物质的合成主要通过群体感应系统调节，群体感应系统通过调节phzA-G操纵子基因来合成1-羟酸吩嗪，然后1-羟酸吩嗪再合成其他吩嗪类分子。吩嗪分子具有与AQDS类似的功能，也可作为电子穿梭体。含氮杂环的吩嗪分子的电子传导能力取决于亲和的质子-电子传递过程，这与三元有机杂环的性质密切相关。但是，关于吩嗪如何参与多种电子传递过程的信息目前非常有限，尤其是吩嗪分子的吸电子基团与供电子基团特征，以及功能基团对电子转移的影响至今仍不清楚。杂环上取代基的不同是吩嗪分子物理和化学性质不同的主要原因，据报道取代基的特点和位置主要决定了吩嗪分子的氧化还原电势、极性和稳定性。

（3）黑色素

黑色素是在生物界普遍存在的一类羟基化聚合物，主要可分真黑色素、棕黑色素、异黑色素和脓褐素。该类物质具有的凝聚相物理性质使其具有导电性能，从而在微生物的电子转移中起到了电子穿梭体的作用。通过对比去除希瓦氏菌algae BrY细胞膜表面黑色素和没有去除黑色素的细菌，发现后者在还原含水氧化铁时的速率是前者的10倍，推测希瓦氏菌MR-1可有效利用环境中的酪氨酸合成脓褐素，从而通过促进固态金属氧化物的还原。

（4）苯醌类物质

苯醌除了被认为是天然有机物中的苯醌成分之外，许多微生物也能够产生这类化合物，如希瓦氏菌产生的甲基萘醌（Hernandez and Newman，2001；Newman and Kolter，2000），灰黄链霉菌的Cinnaquinone渗出物（Glaus et al.，1992），以及希瓦氏菌分泌的黑色素中的奎宁功能基团（Turick et al.，2002）。随着对可溶性电子传递中介体的关注，基于培养实验来鉴定内源介体的研究已经成为人们研究的热点。

1.2.4　土壤腐殖质——电子穿梭体的“聚合体”

1.2.4.1　土壤腐殖质的物质来源

土壤腐殖质的来源极为复杂，通常认为，植物残体是土壤腐殖质的主要来源，其次是微生物残体及其分泌物，土壤动物的贡献最小（Kögel-Knabner，2002）。在陆地生态系统中，进入土壤有机质的数量、化学组成及其化学结构特征对控制土壤腐殖质的形成与转化具有十分重要的作用（Kleber et al.，2007），不同来源的腐殖质在土壤中的命运是有差异的（Wiesenberg et al.，2008）。作为土壤腐殖质重要来源的植物残体在化学组成上与微生物残体、动物残体存在严重的不同，就植物残体本身而言，不同种类、器官、年龄的植物之间也存在显著区别（窦森，2010）。

以往一直认为微生物残体以及分泌物对土壤腐殖质的贡献不超过5%，然而，由于缺乏有效的分析手段可能会使得估算土壤中微生物来源的腐殖质的相对贡献存在很大的不确定性（Dalal，1998）。Clemmensen等（2013）采用碳同位素示踪技术和分子技术对北方森林土壤碳的来源问题进行了评估，发现土壤中50%～70%的碳储量主要是来自根系及与其共生的菌根真菌，尤其是在土壤根系密度较大的层位更为明显，这显然颠覆了以往一直认为的土壤腐殖质主要是来自地上部分植物残体凋落物的认识。传统上认为微生物残体以及微生物分泌物不是构成腐殖物质的主要前体物，然而，基于最近对腐殖物质产生的新认识（Sutton and Sposito，2005），发现腐殖质是植物残体和微生物残体分解的中间产物的混合物质（Kelleher and Simpson，2006）。Simpson等（2007）通过对土壤有机质进行NMR分析，发现土壤中45%的腐殖质是微生物残体或微生物分泌物贡献的。由于黑色素具有与腐殖质相类似的结构组成，因此其通常被推测为腐殖质形成的前体物（Saiz-Jimenez，1996）。然而目前关于土壤中黑色素含量以及分解行为的研究较少，这主要因为黑色素的提取方法和分析技术还存在一定的困难。

1.2.4.2　土壤腐殖质的组成特征

腐殖质在化学上是不均匀的多功能有机分子，在土壤中主要与矿物通过相互作用交织在一起，其含有大量的活性官能团，不仅具有络合金属离子的能力，而且具有很强的氧化还原特性（Aiken et al.，1985；Stevenson，1994）。

由于来源和成岩作用的差异，不同土壤样品腐殖质的化学成分及结构会存在很大的不同，因此无法利用一个统一的化学分子式来准确地对腐殖质进行描述。土壤腐殖质是由复杂的芳香及脂肪结构组成的大分子，这个大分子含有羟基、羧基、氨基、酚基等结构，可以通过红外和核磁共振光谱确定这些结构（Stevenson，1994）。由于其化学结构的多变性，天然腐殖质一直都是按照其溶解性与分子量的标准进行划分。腐殖质可以分为胡敏酸（humic acid，HA，也称腐殖酸）、富里酸（fulvic acid，FA）和胡敏素（humin，HM），其中胡敏素具有比较高的分子量（20～100kDa，1kDa=103g/mol，下同），只溶于碱性环境下，富里酸具有比较低的分子量（0.5～5kDa），在所有的pH值条件下都可以溶解，胡敏素占的比例最大，在所有pH值下都无法溶解（Aiken et al.，1985；Stevenson，1994）。

与通过大分子结构来描述腐殖质特性不同，Piccolo（2001）、Sutton和Sposito（2005）以及Kleber和Johnson（2010）提出了一种新的概念模型来描述土壤腐殖质的结构。根据该模型，土壤腐殖质并不是由单个的大分子组成的，而是由各种有机小分子团通过疏水作用及氢键结合在一起形成的聚合体。当地球化学条件发生变化时，这些键会被加强或者减弱，进而引起结构性的变化，甚至会导致单个有机小分子与聚合体分离（Kleber and Johnson，2010；Sutton and Sposito，2005）。对腐殖质有贡献的可以是各种类型的有机分子，例如脂肪酸、羧酸、乙醇、木质素、糖等，按照原有的腐殖质大分子结构的定义，这些有机分子甚至有可能都不是腐殖质的组成部分（Stevenson，1994）。然而，新的概念模型将这些有机分子作为腐殖质的组成部分（Kleber and Johnson，2010；Sutton and Sposito，2005）。

1.2.4.3　土壤腐殖质的形成机制

腐殖质的形成至今仍是一个谜，因为要研究探索的问题太重要、太复杂以至于出现腐殖质学或腐殖质研究的说法（Paul，2002）。目前对土壤腐殖质的形成机制有多糖-酰胺缩合学说、煤化学说、木质素学说、木质素多酚学说、微生物多酚学说、微生物合成学说、细胞自溶学说（包括植物和微生物）和厌氧发酵学说等多种学说（Stevenson et al.，1994；李阜隶，2003；窦森，2010），其中微生物合成学说、微生物多酚学说、厌氧发酵学说强调微生物的作用，木质素学说强调植物的作用，木质素多酚学说和细胞自溶学说同时承认微生物和植物的作用，煤化学说和糖-酰胺缩合学说则强调纯化学反应的作用。在上述观点中，核心问题是微生物是否参与或在哪个环节参与腐殖质的形成。不过从土壤学的角度，这种分歧的焦点更加具体，即微生物是否直接合成腐殖质或其前体成分。对此持肯定观点的是多酚学说，对此持否定观点的是木质素学说。在解释腐殖质形成途径时，通常认为几种途径可能在各种土壤中都存在，只不过各自所占比重不同。对腐殖质生成机理认识的差异，也影响到对胡敏酸和富里酸形成顺序的推断，按木质素理论是先形成胡敏酸，然后由胡敏酸裂解成富里酸；按多酚理论是先形成富里酸，再由富里酸聚合成胡敏酸，尽管也存在着直接形成胡敏酸的可能性，这意味着在对待腐殖质各组分的演化方向的问题上也存在着根本对立的观点。此外，还有研究显示，不同环境条件下胡敏酸和富里酸的形成顺序也存在差异（Stevenson et al.，1982；窦森，2010）。目前我们只了解了腐殖化过程的一般轮廓，对于过程中的很多具体内容还有待于进一步的研究。

1.2.4.4　土壤腐殖质与类腐殖质的界定

以往很多关于腐殖质的研究有一个特点，像对待土壤一样，把新鲜有机物料、有机肥或菌体本身，以及加入这些物质的土壤作为供试材料，把它们的碱提取液当成胡敏酸和富里酸，剩下的残余物当成胡敏素。但事实上，这些提取物或残余物未必就是真正的腐殖质（Bottomley，1915；熊田恭一，1981），而有些只不过是胡敏酸和富里酸的原始形态（科诺诺娃，1959），因此，我们不能仅仅根据暗色和溶解性来判断提取物是否就是腐殖质，因此明确概念、统一方法和选择判断标准是研究土壤以外介质发生的暗色化现象与腐殖质生成机理的前提。人们对获得的类腐殖质与土壤腐殖质的异同点进行了对比（熊田恭一，1981），但却很少进一步论述异同点的判定标准。综合各种指标是区分类腐殖质与腐殖质的主要手段，过去仅从外观颜色或吸收光谱暗色物质定量来比较，后来用色调系数、相对色度、分解率、褪色率、E₄/E₆等，目前有条件使用更多的结构特征指标，如元素组成、数均分子量、官能团含量、活化度、红外光谱、荧光光谱、紫外光谱、热稳定性、核磁共振波谱、电子显微镜观察等。

1.2.4.5　土壤腐殖质的分解与转化过程

细菌虽然在自然界中分布很广泛，且可以参与腐殖物质的降解，但其降解能力十分有限（Dehorter et al.，1992；Esham et al.，2000；Filip and Tesarova，2004）。相比而言，真菌具有较强的降解腐殖物质的能力（Qi et al.，2004），特别是担子菌中的白腐真菌和凋落物降解菌。子囊菌降解腐殖物质的能力虽然不及白腐真菌和凋落物降解菌，但它对促进土壤中腐殖物质的降解与转化方面仍有相当大的贡献（Rezacova et al.，2006）。白腐真菌和凋落物降解菌是降解木质素的主要菌类（Hatakka，1994），然而，人们发现它们也能有效降解比木质素的结构更为复杂的腐殖物质（Hofrichter and Fritsche，1996；Gramss et al.，1999），这主要是由于它们所产生的非特异性的过氧化物酶（LiP）、锰过氧化氢酶（MnP）与漆酶（EC）能够与腐殖物质上的芳香族基团发生反应。另外，其他种类的木质素降解酶，如GLX、纤维二糖脱氢酶（cellobiose dehydrogenase，CDH）、AAO、多功能过氧化物酶（versatile peroxidase，VP）以及细胞色素P450对腐殖物质的降解与转化也起着十分重要的作用（Grinhut et al.，2007）。

白腐真菌和凋落物降解菌可以采取直接攻击和介导性攻击来降解与转化腐殖质（Grinhut et al.，2007），然而关于其具体的机理过程以及降解产物的物理与化学特征还有待于进一步研究（Grinhut et al.，2007；Grinhut et al.，2011）。腐殖质的降解机理是一个复杂的过程，它与真菌种类、生态环境以及底物特征密切相关（Grinhut et al.，2007）。Dehorter等（1992）将来源于森林土壤的胡敏酸作为基底物质进行微生物培养试验，发现尽管胡敏酸减少了30%，但13C-核磁共振（13C-NMR）的结果却显示胡敏酸的结构特征没有发生明显的变化。然而，在以褐煤的胡敏酸为基底物质来培养白腐真菌的试验中，却发现随着胡敏酸的降解羧基官能团以及脂肪族碳链上的羟基与甲氧基官能团增多，而芳香基官能团则减少（Dehorter et al.，1992；Willmann and Fakoussa，1997）。

1.2.4.6　土壤腐殖质的稳定机制

（1）对分子结构决定论的新认识

将土壤腐殖质视为难降解有机物的观点已经流行了很长一段时间（Stevenson，1994）。以往研究认为腐殖质是生物过程中自发产生的有机物质（Guggenberger，2005），因此它的分子大小与结构具有高度多样性，进而导致土壤中没有相应的特异性降解酶能够对其进行降解（Hedges，1988；Stevenson，1994）。然而，有些研究却认为腐殖物质的结构发生微小的变化都会导致微生物酶发生相应的变化，从而导致腐殖物质的分解成为可能（Sutton and Sposito，2005）。另外，Kelleher和Simpson（2006）通过NMR技术发现腐殖物质并不是一种化学特异性的有机物，而是一种由微生物和植物的生物聚合物结合而成的复杂混合物，而且生物聚合物之间结合力可能也仅是微弱的分子间作用力，例如疏水键和氢键（Sutton and Sposito，2005），这也表明了腐殖物质并非一种难以降解的有机物。

以往一直认为腐殖物质是土壤中稳定碳库的主要组成部分，然而，许多学者通过原位直接观测技术却发现腐殖物质在土壤总有机质中仅占很小的一部分（von Lützow et al.，2006；Kleber and Johnson，2010），而用化学方法从土壤中提取出的胡敏酸类化合物可能是由燃烧产生的（Trompowsky et al.，2005），这对腐殖物质的形成是稳定土壤碳库的重要机制也提出了质疑。最新研究表明，土壤腐殖质稳定与否主要是受微环境系统影响，而并不是由分子结构来决定（Schmidt et al.，2011），这一观点对我们重新认识腐殖质在地球环境中的作用与意义提供了新的思路。

（2）物理保护机制

土壤腐殖质的物理保护机制主要是通过将腐殖质包裹在土壤团聚体与微小孔隙中来避免微生物的接近与攻击（Sollins et al.，1996；Six et al.，2000）。尽管土壤中Fe、Al氧化物或氢氧化物通过非生物因素形成的网状结构是一种重要的腐殖质包裹体（Mayer et al.，2004），但包裹腐殖质主要还是通过生物因素形成的土壤团聚体来实现（Oades，1993；Six et al.，2002）。土壤微团聚体相对于大团聚体具有更好的保护土壤腐殖质的功能（Six et al.，2004）。然而，许多研究发现，相对于粗粒组分，富含微团聚体的粉砂和黏粒组分具有更高的营养利用效率和更强的抵抗捕食者入侵的能力，因此具有更高的微生物多样性（Selesi et al.，2007），这表明仅仅通过微团聚体具有排斥微生物攻击的特性是不足以解释土壤微团聚体是稳定腐殖质的重要场所的观点（McCarthy et al.，2008）。计算机微断层摄像技术是一种非破坏性观察土壤微型结构的十分有利的手段，Peth等（2008）通过该技术观察到土壤微团聚体中具有高度相互连接的微孔网状结构。这种微孔网状结构可以允许氧气以及土壤溶液在其中自由传输，但其中的腐殖质由于被孔隙内壁所吸附或与矿物相互作用不能任意移动，因此，尽管土壤微团聚体中具有丰富的微生物种类，但由于微生物所分泌的酶被固定而无法发挥其应有的生理活性，从而使得微团聚体中的腐殖质能够免受酶的接近而得到很好的保存。然而，目前这方面的研究还仅仅处于初步阶段，关于土壤微团聚体的生物多样性、酶活性以及微孔网状结构之间的具体关系还有待于进一步探索。

土壤腐殖质嵌入层状硅酸盐黏土矿物的夹层中也是一种很好抑制微生物攻击的方式（Kennedy et al.，2002）。尽管土壤中大分子腐殖质在结构上似乎要大于黏土矿物的夹层，但是某些腐殖质的可溶性与弯曲性可使其能够很好地嵌入黏土矿物的夹层中（Schnitzer et al.，1988）。研究表明，嵌入蒙脱石夹层中的有机小分子化合物可发生构象变化，并且在Al3+或Fe3+的催化作用下可以进一步聚合成大分子的腐殖质（Kennedy et al.，2002），这对进一步加强腐殖质的稳定性起到了十分重要的作用。黏土矿物夹层中腐殖质的稳定性可能与同构置换有密切的关系，Tunega等（2007）研究发现蛭石与云母在层状硅酸盐结构的外表层具有丰富的同构置换，从而使其能够形成十分稳定的层间有机分子。迄今为止，对黏土矿物夹层中腐殖质的分析仍缺乏十分有效的手段，对它们的结构与定量研究尚未有清晰的认识（Eusterhues et al.，2003），因此关于黏土矿物夹层腐殖质的稳定机制研究仍需要进一步探索。

（3）化学保护机制

土壤腐殖质与土壤矿物通过相互作用形成腐殖质-矿物复合体是防止土壤腐殖质分解的重要途径（Kalbitz et al.，2005），其相互作用的方式主要有静电作用（阴离子交换）、配位反应、疏水作用、范德华力、氢键、阳离子桥键、水桥以及熵变驱动的物理吸附等（Mikutta et al.，2007）。不同类型的矿物对土壤腐殖质的吸附机制不同，例如，Fe、Al氧化物矿物以配位反应为主，蒙脱石以阳离子桥键为主，而高岭石则以范德华力为主，因此，根据这些结合力的大小，Fe、Al氧化物矿物所结合的土壤腐殖质具有最强的抵抗微生物降解的能力，蒙脱石次之，而高岭石最弱（Mikutta et al.，2007）。通常情况下，土壤中腐殖质-矿物复合体的含量与Fe氧化物的含量呈正相关关系（Mikutta et al.，2006）。

许多研究认为，土壤腐殖质是以单层膜的形式连续分布在土壤矿物的表面，由此指出土壤矿物表面积大小可以用于指示土壤中固持腐殖质含量，即大的土壤矿物表面积有利于固持更多的土壤腐殖质（Wagai et al.，2009）。然而，也有许多报道称土壤腐殖质是以斑块的形式吸附在土壤矿物表面，指出土壤矿物表面积与土壤腐殖质的固持之间没有必然的联系（Kögel-Knabner et al.，2008）。由此可见，关于土壤矿物表面积与腐殖质的固持之间的确切关系仍需要进一步探索。

土壤腐殖质与金属离子相互作用形成络合物也是稳定腐殖质的重要机制，金属离子对微生物的毒性作用以及金属离子对胞外酶的钝化作用可能是造成有机金属络合物具有更高稳定性的重要原因（von Lützow et al.，2006）。另外，络合作用导致的腐殖质品质、分子大小、电荷以及空间结构的变化也可能对稳定腐殖质有一定的贡献（McKeague et al.，1986）。此外，腐殖质与金属离子形成络合物沉淀在一定程度上也可以很好地避免微生物的攻击，特别是对于大分子腐殖质更为普遍（Schwesig et al.，2003）。参与络合作用的金属离子主要有Ca2+、Al3+和Fe3+（Baldock and Skjemstad，2000）。许多研究都一致认为土壤腐殖质通过与Al3+、Fe3+相互作用能够有效地提高其抗降解能力（Nierop et al.，2002）。然而，目前大部分研究结论都是基于间接的证据，对于金属离子对腐殖质稳定性的影响还难以定量描述。

1.2.4.7　土壤腐殖质的电子穿梭官能团

土壤腐殖质同时具有接受电子和提供电子的功能，说明腐殖质可以参与氧化还原反应，不仅是酸碱可溶的胡敏酸和富里酸具有电子转移能力，而且固相的酸碱不溶物胡敏素也具有一定的电子转移能力（Zhang and Katayama，2012）。土壤腐殖质之所以具有很强的电子转移能力主要是由于其结构中含有丰富的电子穿梭官能团。之前很多开创性的工作都是基于腐殖质对硝基芳香化合物还原的影响研究，研究结果显示，腐殖质中奎宁能够刺激氧化还原过程的电子转移（Dunnivant et al.，1992；Tratnyek and Macalady，1989），说明奎宁具有电子穿梭功能。后来有很多证据都支持了这样一个假设，那就是醌类是腐殖质中主要的电子穿梭官能团。电子自旋共振波谱分析直接证明了腐殖质中的醌基团是微生物还原过程中真正接受电子的官能团（Scott et al.，1998）。此外，基因的研究结果显示，Shewanella oneidensis MR-1对奎宁和腐殖质的还原都是基于一个共同的生物化学过程（Newman and Kolter，2000），说明腐殖质确实存在与奎宁相类似的官能团。进一步的研究表明，在腐殖质和AQDS的微生物还原过程中，甲基萘醌是Shewanella oneidensis MR-1电子传递链的必不可少的物质，而缺乏合成甲基萘醌能力的突变体则无法还原AQDS与腐殖质（Newman and Kolter，2000）。通常情况下，腐殖质中的醌含量与腐殖质的电子转移能力存在很好的一致性（Sposito，2011），这也说明了醌基团对腐殖质电子转移具有很大的贡献。还有报道显示，从不同富含有机物环境介质中提取的各种胡敏酸，其电子转移能力与其对应于醌基团的红外光谱强度之间有着很强的联系（Hern􀅡ndez-Montoya et al.，2012），这间接证实了腐殖质中存在醌类的电子穿梭官能团。此外，Aeschbacher等（2010）采用电化学的方法对购买的各种腐殖质标准品进行了电子接受能力的测定，发现腐殖质标准品的电子接受能力与C/H摩尔比及芳香性之间都存在着线性关系，暗示着醌基团可能是影响这些氧化还原反应的主要因子，这与Ratasuk和Nanny（2007）所报道的结果相一致。综上所述，醌基团是腐殖质中非常重要的一类电子穿梭官能团。

实际上，土壤腐殖质中的非醌官能团对其电子转移能力也会起到显著的贡献。采用H₂/Pd反应体系和pH=8的实验条件对腐殖质进行还原后，发现腐殖质在红外光谱1360cm-1处会表现出与对苯二酚基团有关的光谱信号；相反地，采用H₂/Pd反应体系和pH=6.5的实验条件对腐殖质进行还原后，却发现腐殖质并没有表现出对苯二酚的红外光谱信号，但其芳香酮基团却没有什么变化（Hern􀅡ndez-Montoya et al.，2012）。上述现象表明，在H₂/Pd反应系统中，pH=6.5时可以很好地规避腐殖质中醌基团的电子穿梭功能的有效性，这主要是由于在这种体系下醌会被质子化形成酚基（pK_a=9.9），从而阻碍了醌基团的电子转移。Ratasuk和Nanny（2007）的研究表明在pH=6.5的情况下，采用H₂/Pd反应系统对胡敏酸进行还原后，结果发现这种胡敏酸并没有失去电子转移能力，仍然能够促进柠檬酸铁的还原，说明腐殖质中还存在其他非醌类的电子穿梭官能团。基于类似这种规避醌基团电子穿梭功能有效性的方法，人们对来自各种富含有机物的环境介质中的腐殖质样品进行了分析，结果显示，腐殖质中非醌类官能团占总电子转移能力的44%～58%（Hern􀅡ndez-Montoya et al.，2012；Ratasuk and Nanny，2007）。进一步的研究表明，在pH=6.5时，H₂/Pd反应系统对规避醌基团电子穿梭功能的机理是可逆的，许多微生物（例如地杆菌G.sulfurreducens）能够同时还原各种腐殖质中的醌类及非醌类官能团（Hern􀅡ndez-Montoya et al.，2012）。在这些腐殖质样品中检测到的具有明显电子转移能力的非醌官能团可能与含氮及含硫氧官能团有关，例如二甲基砜、3-甲硫基丙酸、n-甲基苯胺、1-甲基-2，5-吡咯烷二酮等（Fimmen et al.，2007）。此外，还有研究显示，腐殖质中络合金属的氧化还原电对也会对腐殖质的电子穿梭功能起到一定的贡献作用（Sposito and Struyk，2001），但这种作用可能相对较小。

目前很多相关学者为了更深入理解腐殖质在非生物的与微生物介导的电子转移过程中所涉及的化学结构及氧化还原性质进行不懈努力。很多光谱与色谱分析技术都可以用于表征腐殖质的化学结构，其中最常用的非破坏性分析方法包括红外光谱、紫外可见光谱、荧光光谱、核磁共振波谱、质谱及其相关技术、X射线技术、色谱层析技术（如凝胶电泳）等。然而，迄今为止，最有用的分析腐殖质氧化还原性质的方法主要是电子顺磁共振波谱、X射线吸收近边结构光谱、傅里叶转换红外光谱和荧光光谱，这些方法对揭示腐殖质的氧化还原状态和氧化还原活性已经做出了许多贡献。氧化还原状态指的是氧化还原活性官能团被氧化或被还原的相对程度；而氧化还原活性则是指腐殖质接受或者提供电子的能力。尽管目前关于腐殖质氧化还原状态和氧化还原活性的化学层面的研究取得了很大的进步，但是依然存在许多问题有待于进一步研究，以便更全面地理解和预测自然生态系统中腐殖质的生物地球化学行为以及工程系统中由腐殖质介导的氧化还原过程。